银杏(Ginkgo biloba)是第四纪冰川之后唯一在中国保存下来的孑遗物种，美国的Wilson认为，该种于六世纪从中国传到日本(Li, 1961)。1730年，Kaempfer首次将银杏引种到荷兰乌得勒支(Utrecht)植物园(Lee, 1955; Seward, 1938; Li, 1961)。关于银杏的分类，Carriere于1867年、Beissner于1887年及Henry于1906年将种下分成变种(var.) (Seward, 1938)。目前，‘Variegata'、‘Pendula'、‘Fastigiata'、‘Laciniata'等这些变种因其叶形、叶色、树形等形态上的变异已成为重要的特异种质资源(Li, 1961; Santamour et al., 1983)。自20世纪初，诸多学者对银杏细胞遗传学的研究主要集中在寻找雌雄株染色体形态上的差异及对性染色体的确定上。1910年日本学者Ishikawa首次报道了银杏染色体为2n=24(Ishikawa, 1910), 之后Herzfeld(1928)、Shimamura(1928)、Sax等(1933)、Tanaka(1952)、Newcomer(1954)、Lee(1954)分别予以证实。Eichhorn(1928)首次报道了银杏染色体上有随体，并认为这可能与性别有关。Pollock(1957)、陈瑞阳等(1992)、陈学森等(1996)均对银杏性别及核型进行了研究。Kim(1995)利用来自韩国7个省的银杏根尖研究了银杏核型。核型分析对裸子植物及被子植物细胞遗传学有重要意义(宋艳梅等, 2002; Watanabe et al., 1999; Lubaretz et al., 1996; 张守攻等，2005; Salas et al., 2004; Araneda et al., 2004)。最近Royer等(2003)和Murray等(2002)分别对银杏的进化保守性和分子细胞遗传学进行了研究。但到目前为止，关于银杏特异种质核型及其进化趋势未见报道(邢世岩等，2004；2005)。本研究对来自中国、法国、美国、日本及荷兰共计21个银杏特异种质的核型进化趋势进行了研究，以期为银杏种质细胞生物学、遗传学分类，以及探明该物种的演化趋势奠定基础。

1 材料与方法 1.1 银杏种质

银杏特异种质系指树形、叶形、叶色等已具明显变异的观赏变种或品种。21个特异种质均采自山东农业大学银杏种质资源基因库(表 1)。对照(CK)为普通银杏种子培育的实生树(3年生)。国外种质系1998年从法国蒙特利亚尔Pépinières Adeline苗圃引进。

1.2 试验方法

2003年3月中下旬，从嫁接的3年生树上采集幼叶带回室内，用0.1%秋水仙素与0.002 mol·L^-1 8-羟基喹啉混合液于室温下活体预处理8 h。用卡诺固定液(Carnoy)固定20~24 h，然后，用1 moL·L^-1 HCl于60 ℃水浴中解离15 min，再用2%纤维素酶-果胶酶(质量比为4:1)混合液于30~37 ℃酶解约6 h，水洗去酶液，用上述固定液固定约20 min。用改良卡宝品红(Carbol)染色液染色及压片。用Olympus显微镜(2 000倍)对处于分裂中期的染色体照相。每个品种观察50个细胞，以5个细胞的平均值得出核型的平均值。

核型分析采用Levan等(1964)两点四区系统法，核型分类依据Stebbins(1971)的对称性标准，同时参照李懋学等(1985)的核型分析标准，染色体相对长度组成用Kuo等(1972)方法计算与命名，即染色体相对长度系数(index of relative length，IRL) > 1.26为长染色体(L)，1.01 < IRL < 1.25为中长染色体(M₂)，0.76 < IRL < 1.00为中短染色体(M₁)，IRL < 0.76为短染色体(S)，共4种类型。核型不对称系数(asymmetrical karyotype coefficient, As.K.c)按Arano等(1975; 1963)方法计算，即As.K.c(%)=长臂总长/全组染色体总长；染色体总形态百分比(total morphological percentage, TM, %)按短臂总长/全组染色体总长计算。种质间遗传距离是通过主成分分析，在特征根λ_i中选取信息量85%以上的特征向量，并按郭平仲(1993)方法计算种质间遗传距离(D_ij²)：，式中G_ik和G_jk分别示种质i和j第k个性状的标准化基因型值。对D_ij²采用SAS程序进行Q型聚类。

2 结果与分析 2.1 染色体及核型分析

第四纪冰川之后，尽管银杏经历了漫长的地质年代变迁，种核、树形、叶形等发生了一系列变异，但根据对21个特异种质约1 100多个细胞的观察，未发现染色体非整倍及多倍体(图 1，图版Ⅰ-1~22)，均为二倍体，染色体数目皆为2n=2x=24=4m+8sm+12st。这与Pollock(1957)的结果一致(陈瑞阳等, 1992; 陈学森等, 1996)。美国康涅狄格大学的Newcomer(1954)及Royer等(2003)认为这一物种具有极强的遗传稳定性。

研究结果(图 1, 图版Ⅰ-1~22)表明：21个特异种质的核型基本一致，第1、2对为具中部着丝粒染色体，第4、8、9、10对为具亚中部着丝粒染色体，第3、5、6、7、11、12对为具亚端部着丝粒染色体。最长染色体与最短染色体之比均大于2，除第1、2对染色体臂比(arm ratio, AR)低于2.0以外，其他的均大于2.0，AR大于2:1的染色体占83.33%。22个种质长臂长(long arm length, LL)平均5.42 μm，cv为21.9%，最大为6.70 μm (美国的‘Aut.', )，最小为4.58 μm (法国的‘Tre.’)，方差分析达极显著水平(F=2.36^**)。短臂长(short arm length, SL)平均2.21 μm，cv为63%，最大为2.94 μm (日本的‘Tit’)，最短为1.83 μm (法国的‘Tre.’)。绝对总长(absolute total length, TL)平均为7.64 μm，cv为9.95%，最大为9.34 μm (‘Aut.’)，最小为6.41 μm (‘Tre.’)，F检验达极显著水平(F=1.35^**)。染色体长臂相对长度(long arm relative length, LRL, %)来自美国的‘San.’和法国的‘Pen.’最大，均为6.04%，而‘Pri.’为5.83%，‘Tit’为5.66%。短臂相对长度(short arm relative length, SRL, %)则相反，‘Tit’和‘Pri.’最大，分别为2.68%和2.51%；而‘Pen.’和‘San.’分别为2.31%和2.30%。根据Stebbins(1971)的核型分类标准，银杏核型属于不对称的3B型(Arano, 1963)。

2.2 核型进化趋势分析 2.2.1 平均臂比(MAR)、长度比(LR)及核型不对称系数(As.K.c)分析

平均臂比(mean arm ratio, MAR)和长度比(length ratio，LR)可以表示不同种质间核型的不对称性，二者愈大，其核型愈不对称。从二维进化趋势图(图 2A)可以看出：1)与对照相比，21个种质均表现沿MAR和LR增加的趋势进化；2)核型呈明显的“双向进化趋势”，即一些种质沿MAR进化较快，如‘San.’的MAR比对照提高了17.71%；相反某些种质沿LR进化速度较快，如‘Tit’的LR比对照提高了52.14%。该结果与云杉(Picea asperata)进化类似(石大兴等，1994)。

平均臂比(MAR)和核型不对称系数(As.K.c)则从另一个角度反映了核型的不对称性，二者愈大，核型愈不对称。利用MAR和As.K.c的二维进化图(图 2B)发现，供试的22个种质均按MAR和As.K.c向右上角方向进化，‘San.’、‘Oha.’、‘Chu.’等MAR及As.K.c均最大，最为进化；而相比之下CK和‘Tit’则较原始。回归分析LR=5.651-1.000MAR, 呈负相关(r=0.257^*)，回归方程检验达显著水平，F=1.412^* > F_0.05=0.249；As.K.c=53.646+5.909MAR, 呈强度的正相关(r=0.703^**)，回归方程检验达显著水平(F=19.522 ^**)。回归分析结果与进化图结果是一致的。

供试的22个种质LR值2.05~3.91 μm，MAR值2.71~3.19 μm, TM值27.56 %~32.13%，而As.K.c在67.88%~72.44%之间，且LR变异系数较大(表 2)。

2.2.2 染色体相对长度系数(IRL)分析

供试的22个种质，IRL平均1.00，cv为20%，最大值为1.01(‘Male’), 而日本的‘Tit ’最小，为0.99。与核型不同，银杏不同种质染色体长度组成呈现较大的变异(表 3): 1)与对照相同，63.6%的供试种质仅含有1条长染色体(L)，但来自美国的‘Fai.’、‘Pri.’，法国的‘Hor.’、‘Fas.’，日本的‘Tit’及中国的‘Ban.’和‘Pin.’具有2条L，中国沂源的‘叶籽银杏’(‘Yez.’)具有3条L，染色体长度的演化较明显；2)中长染色体(M₂)从1~6条不等，美国的‘Sar.’和中国的‘Pin.’仅有1条，而日本的‘叶籽银杏’(‘Oha.’)多达6条M₂染色体；3)与M₂相比，银杏种质中短染色体(M₁)变幅更大(2~10条)，美国的‘萨拉托格’(‘ Sar.’)多达10条M₁，中国的‘平展银杏’(‘Pin.’)和‘窄冠银杏’(‘Nar.’) M₁为9条，荷兰的‘Lei.’和法国的‘Tre.’各具8条M₁；4)值得注意的是，81.8%的种质含有1~5条短染色体(S)，沂源的‘叶籽银杏’S为5条，日本的‘垂乳银杏’(‘Tit’)为4条，而美国的‘Sar.’、荷兰的‘Lei.’、中国的‘Pin.’和‘Nar.’4个种质无S染色体，表明染色体均有加长趋势。

2.2.3 遗传距离聚类分析

采用LR、MAR和As.K.c三因子主成分分析，据D_ij² Q型聚类发现，‘Sar. ’和‘Tre.’2个种质的D_ij²最小，为0.18，而‘Tit’与其他种质遗传距离最大，为1.94。供试的22个种质可以划分为4类(图 3，表 4)，相比之下，第Ⅲ类‘San.’、‘Aut.’等6个种质MAR和As.K.c较大，进化程度较高。上述三因子遗传距离聚类结果与其种质的形态特征的关联度不大(表 1)，即同一类的种质其叶形、树形等存有较大差异。

3 结论与讨论

银杏染色体数目目前还未发现多倍现象。根据Lima-De-Faria的“染色体场”(chromosome field)理论(岳爱琴等，2001)，真核生物染色体可以分为4级，第3级染色体长度4~10 μm，着丝粒和端粒之间的距离适宜，包含有DNA序列的主要类型，染色体场处于最适宜的基因调控和表达状态。银杏22个种质平均染色体长度7.46 μm，属于中等大小染色体(第3级)，总体上染色体在遗传上呈现较高的保守性和稳定性，这也是自然选择的结果。

Levitzky早在1931年就曾指出，有花植物中核型进化的主要趋势是不对称的不断增加，即随着物种的进化，染色体变得愈来愈不对称(朱徽, 1982)。Stebbins(1971)进一步发展了上述理论，把核型从对称至不对称分为1A-4C共12个类别，并认为核型不对称的增加，或者表现为染色体两臂的增加，或者表现为染色体两臂长度不等，或者是同一核内不同染色体大小不等。前者可用平均臂比(MAR)表述，而后者可用染色体长度比(LR)表述。本研究用MAR-LR和MAR-As.K.c双维空间进化图表明，后者更能确切反映银杏特殊种质的进化趋势，这与Arano(1963)结论是吻合的，即As.K.c愈大，染色体愈不对称，其进化程度愈高。As.K.c标准也称着丝点端化值(T.C)，在云杉核型分析中应用效果较好(石大兴等，1994)。

尽管银杏特异种质核型相对稳定，但其果核、叶形、叶色、树形上的形态变异也许与其染色体长度组成的改变有关，本研究表明，IRL能准确反映银杏特异种质染色体长度的异质性及多样性，这对于细胞遗传学有重要意义。银杏种质进化也许与长染色体(L)增加、短染色体(S)有无及中长染色体(M₂)和中短染色体(M₁)的多少有关。Tanaka等(1952)曾表明，苏铁(Cycas revoluta)属较不对称核型, 与银杏同属3B型，这与王伏雄等(1983)根据银杏的精子结构和原胚发育研究得出的结论一致。王伏雄等(1983)认为银杏、苏铁和松杉类可能起源于共同的祖先，而且裸子植物是单元发生的。银杏的演化趋势是叶片扁化、蹼化和融合，胚珠增大、数目减少、株柄趋于消失(周志炎，2003)。

利用遗传距离(D_ij²)进行系统聚类发现，供试的22个种质可以分成4类，而日本的‘垂乳银杏’(‘Tit’)相对较原始。聚类分析可以更详细地说明不同种质的进化程度和亲缘关系。值得注意的是中国和日本的‘叶籽银杏’(‘Yez.’和‘Oha.’) D_ij²明显不同，这也许与前者有较高的长度比(LR)，而后者有较高的臂比(MAR)有关。但MAR-As.K.c进化图表明，中国的‘Yez.’比日本的‘Oha.’更原始。叶籽银杏的个体发育反映了银杏目系统发育过程的某些特性。对叶籽银杏的评价, 国内学者多解释为“返祖现象”，基于发生形式的相似性，认为其返祖的历史可以追溯到种子蕨亚纲(Pteridopermidae)(马丰山等，1991)，而傅德志等(1993)认为银杏类的祖先可能为古裸子植物科达类(Cordaites)。Sakisaka(1929)则认为叶籽银杏属于“衰老现象”(senile form)。本研究还没有充分理由支持‘叶籽银杏’属于“返祖现象”这一说法(邢世岩，1993；郭善基，1993；Sakisaka，1929；1927)。‘金丝银杏’(‘Jin.’)、‘斑叶银杏’(‘Ban.’)、‘叶籽银杏’(‘Yez.’)、‘平展银杏’(‘Pin.’)、‘垂叶银杏'(‘Chu.’)、‘萨拉托格’(‘Sat.’)、‘金秋’(‘Aut.’)、‘塔形银杏’(‘Fas.’)、‘垂枝银杏’(‘Pen.’)、‘筒叶银杏’(‘Tub.’)和‘垂乳银杏’(‘Tit’)等树形、叶形、叶色已具明显变异的种质其核型聚类与形态特征无关联。因此，采用AFLP等分子标记分析银杏特异种质亲缘关系尤为重要(Wang et al., 2006)。