石楠(Photinia serrulata)属于蔷薇科(Rosaceae)石楠属常绿阔叶灌木至小乔木。同属植物我国产40余种，其花果叶均可观赏，属园林中观赏季节特长的一类花木。石楠原产我国中部及南部，抗寒性较强，在暖温带地区有一定的应用前景，已有少数成苗在北京引种，能够正常开花结实(郑淮兵等, 2005)。目前石楠的适用地区在不断扩展，并陆续有大量新品种出现，对其资源保存的研究具一定意义。石楠及同属一些栽培品种的组培技术成熟(段祖安等, 2000；李慧, 2004)，并且同科植物如杏(Armeniaca dulcis)(Chockpisit et al., 2000)、樱桃(Cerasus)(Niino et al., 1997)等的茎尖，枇杷(Eriobotrya japonica)(王家福等, 2004)、杏(Armeniaca vulgaris)(王彩虹等, 1996)等的花粉超低温保存及枇杷试管苗常温(王家福等，2002)、低温保存(刘丹学等，2004)均已见报道，但未见对石楠种质资源超低温保存方面研究的报道。

常规的离体保存需要经常继代，耗费大量人力、物力，而且易污染和变异。玻璃化法超低温保存具有设备要求简单、材料处理步骤简便、效果和重演性好等优点(王君晖等, 1994; Yakai et al., 1998)，是目前较为理想的植物种质资源长期稳定的保存方法，尤其适合组培物和茎尖培养物的保存，已经成功应用于几十种植物的茎尖保存。本试验采用玻璃化法进行石楠茎尖的超低温保存，以期建立石楠茎尖的超低温保存体系，为长期稳定保存石楠种质资源打下一定基础。

1 材料与方法 1.1 材料

以石楠的带芽茎段为外植体，参照段祖安等(2000)建立茎尖无菌培养体系。以继代4代培养3 0 d左右的茎尖为试验材料。

1.2 方法

1) 装载与脱水  切取继代培养30 d左右长度为0.5，1.0，1.5，2.0，3.0 mm的石楠茎尖，装入effendoff管，在室温条件下用60%的PVS₂溶液[0.4 mol·L^-1的蔗糖液体培养基与PVS₂溶液(30%甘油，15%乙二醇，15%DMSO，0.4 mol·L^-1蔗糖)体积比为2:3]处理10 ~60 min，然后在0 ℃条件下PVS₂溶液处理20~60 min。2)冻存  在effendoff管中换入新鲜的0 ℃ PVS₂溶液，迅速投入液氮，10个茎尖为一个处理，重复3次。3)化冻与再生植株培养  液氮中保存24 h后取出冻存管，迅速投入40 ℃水浴化冻，解冻后立即用含有1.2 mol·L^-1蔗糖的MS液体培养基洗涤2次，每次10 min。用TTC法检测茎尖存活率。或吸去材料表面液体将茎尖转入MS+6-BA 2.0 mg·mL^-1+蔗糖3%的固体培养基暗培养，1周后转入正常光照培养，统计再生率。

2 结果与分析 2.1 茎尖长度对冻后存活率的影响

切取长度分别为0.5、1.0、1.5、2.0、3.0 mm的石楠茎尖，室温下用60%PVS₂溶液处理40 min，0 ℃条件下用PVS₂溶液处理50 min。经液氮冻存后，对茎尖进行TTC活性检测。结果表明茎尖长度在1.5、2.0 mm存活率最高，为70%~73.33%；0.5 mm茎尖冻后存活率很低，只有6.67%，可能是由于体积过小，切割对材料伤害较大，并且玻璃化溶液对材料的毒害也较大，导致茎尖死亡；3.0 mm茎尖的存活率较低，可能是由于材料体积过大，导致脱水处理不够充分，迅速降温时材料局部降温速率不一致，影响玻璃化溶液保护作用的发挥，对材料造成损伤。

2.2 装载溶液处理时间对冻后存活率的影响

切取2.0 mm长的茎尖，用60%PVS₂溶液室温下分别处理10、20、30、40、50、60 min，PVS₂溶液在0 ℃处理50 min。经液氮冻存后，对茎尖进行TTC活性检测。由图 1可见，装载处理时间从10~60 min冻后茎尖都有一定的存活率，为3.33%~86.67%。随处理时间延长，最初存活率不断提高，处理时间达到40 min时，茎尖存活率最高，为86.67%；随后处理时间的延长反而导致存活率下降，处理时间60 min时存活率为73.33%，仍高于处理30 min时的茎尖存活率。因此，装载时间在40~50 min较为适宜；装载溶液渗透茎尖使其逐步脱水需要一定时间，但随着时间延长，对茎尖也有一定毒害。因此需要根据材料的特性准确控制装载时间，使装载溶液既发挥最大作用，又使伤害降至最低。

2.3 PVS₂预处理时间对冻后存活率的影响

切取2.0 mm长的茎尖，室温下用60%PVS₂溶液处理40 min，PVS₂溶液0 ℃下分别处理20、30、40、50、60 min。经液氮冻存后，对茎尖进行TTC活性检测。由图 2可见，PVS₂预处理20~60 min冻后茎尖都可以存活，存活率为16.67%~93.33%。随处理时间延长，最初存活率不断提高，处理时间达到50 min时，存活率最高，为93.33%；随后处理时间延长反而导致存活率的下降，处理60 min时存活率为86.67%，仍高于40 min的茎尖存活率。因此，PVS₂预处理时间在50~60 min较为适宜。PVS₂溶液使材料脱水需要一定时间，随时间延长脱水越来越充分，茎尖存活率不断提高，但如果时间过长，即便是0 ℃条件下PVS₂对茎尖的毒害作用也会逐渐显现出来，影响存活率，因此根据材料特性准确控制PVS₂处理时间，可最大限度地保护茎尖，提高冻后存活率。

2.4 茎尖植株的再生

冻后茎尖接种到含6-BA 2.0 mg·L^-1的MS固体培养基上，一周后可观察到萌动的现象，50 d左右可发育成完整小植株，从外部形态上看与未经冻存的石楠茎尖发育形成的小植株之间没有明显差异(图 3)。冻后茎尖的再生率为41.67%，与TTC法检测的茎尖存活率有差异。可能是由于TTC法是以表征细胞呼吸活性的过氧化脱氢酶活力为检测标准，虽然它是细胞内的重要指标，但不能完全表征细胞与组织的再生能力，因此冻存后茎尖的活力不能仅以此衡量。TTC法的优点在于能够迅速简便地反映冻存后茎尖的状况，在其他通过玻璃化法超低温保存植物茎尖的研究中，TTC法检测的茎尖存活率也基本上与冻后茎尖再生的趋势一致(刘云国等，2002；张玉芹等，2004；艾鹏飞等，2003；王子成等，2001)。此外，再生时的培养基配方与培养条件的不适也会导致茎尖再生困难，还需进一步研究与优化。

3 结论与讨论

石楠茎尖玻璃化法超低温保存比较适宜的程序为：切取1.5~2.0 mm长的茎尖，室温下用6 0%PVS₂溶液处理40 min，再用PVS₂溶液0 ℃处理50 min，更换新鲜的PVS₂溶液后，迅速投入液氮中。需要时取出在40 ℃水浴化冻，解冻后立即用含有1.2 mol·L^-1蔗糖的MS液体培养基洗涤2次，每次10 min，然后接种到再生培养基MS+6-BA 2.0 mg·mL^-1+蔗糖3%上暗培养，一周后转入正常光照培养。

冻存后石楠茎尖的成活率和再生率分别为93.33%和41.67%。TTC法检测结果与茎尖的再生结果还有较大差异，可通过进一步优化保存条件与步骤来提高成活率。Matsumoto等(2003)优化试验步骤使冻后葡萄(Vitis)茎尖再生率由60%提高至80%。石楠茎尖经过本试验的步骤保存后，存活下来的材料均为经过茎尖直接成苗，而不是经愈伤组织诱导后成苗，变异几率小，能够真实稳定地保存石楠的遗传特性。Chockpisit等(2000)在保存杏茎尖时发现，只有一部分茎尖能够直接成苗，大部分在生长一段时间后完全愈伤化，一部分愈伤组织可以转变为胚性愈伤组织，通过体细胞胚胎发生途径实现植株再生，也有些愈伤组织最后死亡；将保存后的茎尖先在无激素的培养基上培养2周，然后转移到有激素的培养基上，可克服这个问题。

超低温保存过程中，材料在液氮中保存的时间长短可能不是影响保存效果的因素。保存1 d和保存3个月的石楠在保存效果上没有明显差别。有文献显示，保存1 d和保存10个月的樱桃在保存效果上也没有明显区别(Niino et al., 1997)，至于超低温保存过程给材料造成的损伤及其对保存效果、材料遗传特性的影响，有必要从细胞的超微结构上对其进行探讨。