等位酶(allozyme)是同工酶的一种, 是同一基因位点不同等位基因所编码的一种酶的不同形式, 是结构基因编码的产物, 遗传和表达遵循孟德尔定律。通过一定方式的电泳, 从酶谱上可以分析、识别出编码它们的等位基因, 再统计出各种等位基因频率和基因型频率, 便可进一步计算出群体的各项遗传学参数, 从而了解一个群体的遗传结构(王中仁, 1996)。对一个物种的遗传结构进行研究, 有助于理解该物种的地理变异模式、遗传多样性等, 并提供为该物种遗传资源保护、利用做出决策的重要信息(沈浩等, 2001; 金燕等, 2003)。等位酶分析方法广泛应用于研究天然居群的遗传结构、基因丰富程度以及栽培植物种质资源遗传多样性及树木种源群体遗传变异模式等(车永和, 2003; 甘四明等, 1998)。

刺槐(Robinia pseudoacacia)别名洋槐, 属豆科刺槐属, 落叶乔木, 原产美国东部的阿柏拉契山脉(Appalachian Mt.)和奥萨克山脉(Ozank Mt.)一带, 在世界各地广泛种植。刺槐资源丰富, 开发、利用刺槐资源是很多学者一直关注的课题(Keresztesi, 1993; Major et al., 1998; Liesebach et al., 2004)。Surles等(1989)通过对1 178个刺槐个体18种等位酶的测定, 分析了美洲刺槐自然分布区刺槐的遗传结构; 杨敏生等(2004a; 2004b)测定了900个刺槐个体11种等位酶, 分析了欧洲刺槐的遗传结构。我国于1898年引入刺槐, 目前已遍布全国各地(山东省林业研究所, 1974), 在不同的自然条件和人工种植条件下, 经历自然选择和人工选择, 形成了刺槐次生种源。我国学者从形态、生理、抗性、遗传、育种、生产等多层次对刺槐栽培与利用进行了研究, 但至今在分子水平有关刺槐群体的遗传结构尚缺乏研究(彭鸿等, 2003)。本文以我国刺槐群体为试验材料进行了等位酶测定和分析, 以期从分子水平研究我国刺槐的遗传结构和遗传变异规律, 为刺槐种源试验、良种选育、创造高生产力的人工林生态系统提供理论依据。

1 材料和方法 1.1 材料

通过当地林业局、林场、林业技术指导站、种子经销站等途径, 广泛搜集国内刺槐种源19个, 包括吉林、辽宁、内蒙古、甘肃、山西、陕西、河北、河南、天津、山东、湖北、安徽、云南等13个省(市、区)的刺槐种子, 2004年春天播种于河北农业大学教学实验场, 苗期各省区刺槐随机标号取样, 每个种源取32个单株个体, 共608个样本(金燕等, 2003)进行等位酶测定。各地种源的来源如表 1。

1.2 测定酶系统和方法

本项研究测定了7个等位酶系统。各等位酶基本情况描述见表 2。试验采用水平切片淀粉凝胶电泳和不连续聚丙烯酰胺凝胶电泳分离等位酶。淀粉凝胶电泳胶浓度为15 %; 聚丙烯酰胺凝胶电泳浓缩胶浓度为2.5 %, 分离胶浓度为7.5 %。两种胶的制备参见Hertel等方法(1999)。

每个单株取新鲜叶片(成熟叶片染色效果较好)约0.5 g, 加入600 μL提取缓冲液研磨提取酶液。提取液组成、电泳、割胶参见王中仁(1996)和Hertel等(1999)方法。各种酶系统的染色按表 3配方配制染色液进行染色, 染色的胶片在37 ℃左右的温箱中温育至显色清楚为止, 酶的活性高, 谱带易模糊; 胶片时间长, 酶谱也易变模糊或褪色(王中仁, 1996), 因此, 酶谱判读要及时, 且需积累一定的经验, 一种酶的多个胶片判读结果要相互对比、校正。7种等位酶酶谱及基因型判读模式见图 1~7, 图中标出部分酶位点的基因型。

1.3 遗传参数计算

将测定的样本不同基因位点基因型数据进行统计分析, 根据王中仁(1996)提供的方法计算下列各项群体遗传学参数和多样性指标:每位点基因型数(G)、等位基因的基因频率(p)、每个位点等位基因数(A)、每个位点的等位基因有效数目(Ae)、平均每个位点预期杂合度(He)、平均每个位点实际杂合度(Ho)、固定指数(F)等进行遗传多样性分析。

2 遗传参数结果与分析

本试验刺槐群体(608样本)的各位点各等位基因的频率列于表 4, 部分遗传学参数列于表 5。

位点等位基因数目反映各位点的等位基因多态性, 在调查的7种等位酶系统中, 共有14个位点, 其中, Fe的A位点酶谱模糊, 难以识别, 6 -Pgd的A位点为单态性, 故两位点不在统计分析中, 其余的12个位点都为多态性, Amy有A、B两位点, 分别有5个和3个等位基因, 其中等位基因A2、A4、B1和B2为频率较高等位基因; 另10个位点中, Fe的B、C两位点、Lap的A、B两位点和Idh的A位点都有4个等位基因, Mdh的B两位点和Skd的A位点都有3个等位基因, Mdh的A位点、6 -Pgd的B、C两位点都只有2个等位基因。在Lap的A、B两位点中, 等位基因A2和B2为频率较高等位基因, 在Mdh的A、B两位点中, 等位基因A2和B2为频率较高等位基因, 其余各位点的等位基因频率比较接近。

等位基因频率反映了等位基因在群体中出现的次数多少, 是进行其他遗传学参数分析的原始资料。Amy的A位点中, 等位基因A2和A4出现频率较高, 分别为0.739 5和0.156 0, 几乎占该位点基因频率的90 %, 在B位点的3个等位基因中, 出现频率相差也较大, B2和B1频率较高, 分别为0.602 3和0.313 3, 而B3频率较低, 仅为0.084 4。其他位点中, 都有1个或2个出现频率较高的等位基因, 如Fe的B2和B3、C2和C3;Lap的B2;Idh的A2和A3;Mdh的B1和B2;Skd的A1和A2等。在6 -Pgd两位点和Mdh的A位点中, 只有2个等位基因, 且2个等位基因的频率都较高。而在LapA位点的4个等位基因中, A1、A2、A3频率都较高, 分别为0.284 9、0.471 1和0.243 0, A4频率最低, 只有0.001 0, 由于各种源出现的等位基因数目及频率不同, 在整个群体等位基因平均数目为2.950 0。

等位基因的有效数目(Ae)反映等位基因在群体中的重要性, Ae越大, 说明等位基因在群体中的作用也越大。在Amy的A位点中, 虽然有5个等位基因, 但等位基因A2的频率很高, A4频率也较高, 但比A2的频率小很多, 另外A1、A3、A5等3个等位基因频率很低, 因此Ae较小, 说明A1、A3、A5这3个等位基因在刺槐群体遗传结构中所起的作用相对较小; B位点中, 虽然B3的频率较小, 但B2和B1的频率较高, Ae也较大, 说明3个等位基因在刺槐群体遗传结构中所起的作用相对较大。其他位点中, Ae变化范围为1.592 8 ~ 2.761 2, 说明在调查的刺槐群体中, 各个等位基因在群体遗传结构中的作用相对较大, 但也存在差别。

实际杂合度(Ho)和预期杂合度(He)反映出群体的遗传变异性大小, Ho越大, 说明群体内的杂合度越高。在调查的大部分位点中, Ho和He比较接近, 数值较高, 变化范围分别为0.187 6 ~ 0.676 6和0.373 0 ~ 0.622 4, 说明大部分位点的杂合度较高, 而在Lap的B位点、Mdh的B位点、6 -Pgd的C位点, Ho比He小, Ho分别为0.187 6、0.295 3和0.250 0, 说明这几个位点的纯合度较大。在6 -Pgd的两个位点, 都只有2个等位基因, 纯合体几率大; Lap的B位点虽然有4个等位基因, 但Ae较小, 且Ho又比He小, 即实际群体中, 该位点纯合度高; 而Mdh的B位点虽然也只有2个等位基因, 但Ae相对高一些, 且Ho又与He接近, 即实际群体中, 该位点杂合度相对高一些。

固定指数(F)反映居群的基因流、近亲繁殖情况等, F值变化在-1与+1之间, F值越小, 杂合子越多, F值越大, 纯合子越高, F值为0, 则说明群体是随机交配的, 等位基因频率符合哈迪-温伯格平衡(HardyWeinberg)理论。本试验整个群体的F平均值为0.084 6, 表明刺槐群体平均杂合度较高, 整个群体各酶位点F平均值变化范围为-0.151 2 ~ 0.496 8, Amy的B位点最小, 为-0.151 2, 表明刺槐群体该位点的杂合度最高, 而Lap的B位点F平均值最大, 为0.496 8, 表明刺槐群体该位点的纯合度最高, 另外Mdh的B位点、6 - Pgd的B、C位点F平均值也相对较大, 分别为0.228 5、0.204 7和0.225 1, 同样说明刺槐群体这3个位点纯合度相对较高, 而其他大部分位点的F平均值变化在0左右, 杂合度高, 随机交配利率高。

3 讨论与建议

本项研究利用等位酶分析, 从群体水平讨论了我国刺槐的遗传结构, 证明了我国刺槐群体杂合度高, 我国刺槐群体有很高的遗传多样性。杨敏生等(2004a;2004b)、Major等(2004)分析欧洲刺槐群体的遗传结构, 取材地理范围为北纬47.09°—52.38°, 东经11.12°—22.18°, 基因位点平均等位基因数目为2.769, He变化范围为0.284 ~ 0.449, Ae变化范围为1.411 ~ 1.854, F种源间平均值为0.080, 变化范围为-0.004 ~ 0.197; Surles等(1989)分析美洲刺槐自然区刺槐群体的遗传结构, 取材地理范围为北纬32.84°—40.80°, 西经94.13°—77.92°, 基因位点平均等位基因数目为2.610, He变化范围为0.250 ~ 0.322, Ae变化范围为1.44 ~ 1.65, F种源间平均值为0.064, 变化范围为-0.004 ~ 0.176;本项研究取材地理范围为北纬25.04°(昆明市)—42.53°(开原市), 东经102.73°(昆明市)—126.17°(集安市), 基因位点平均等位基因数目为2.950 0, He变化范围为0.373 0 ~ 0.622 4, Ae变化范围为1.592 8 ~ 2.761 2, F种源间平均值为0.084 6, 变化范围为- 0.030 5 ~ 0.135 8。与美洲、欧洲刺槐群体相比, 我国刺槐群体同样有很高的遗传多样性, 由此推断, 由于刺槐的适应性较广, 尽管个别酶位点的纯合度相对高(Lap的B位点、Mdh的B位点、6 -Pgd的C位点), 刺槐在我国发生遗传漂变的可能性小, 而在不同的生态条件下形成了新的生态型。本项研究取材地理范围虽然较广, 但分布相对较集中, 一些省份收集2 ~ 3份, 而对于刺槐面积较大的南方一些省份(如江西省)则比较缺乏, 在开展本项研究的同时, 我们仍在收集国内不同地区的种源, 补充更多的种源以深入本项研究。

我国地域广阔, 生态环境差异大。刺槐适应性广, 在不同的生态条件下有可能形成不同的生态型。梁玉堂对我国各地刺槐进行抗旱、抗寒、抗热等生理指标测试, 证明刺槐在我国已形成了次生种源¹⁾。为进一步探究国内刺槐群体不同种源的遗传结构, 从不同角度反映我国刺槐群体的遗传多样性和遗传变异模式, 本项研究还利用DNA标记对本次试验的608个个体进行了SSR分析。这样分别用等位酶标记和DNA标记从不同角度对比分析此次试验19个种源的遗传差异, 这将为刺槐资源开发、育种、种植区划提供更明确的理论依据。对于我国刺槐群体不同种源的遗传结构差异, 我们将从等位酶标记和DNA标记在今后的报道中深入讨论。

1) http://rsxx.sdau.edu.cn/lyt.htm 2005

不同的遗传标记各有其优缺点。形态标记形象直观, 但周期长, 且受环境影响较大, 误差较大; 基于DNA序列特征的分子标记可以检测编码区或非编码区DNA序列的多态性, 能更好地反映群体间的遗传分化和群体内的亚分化, 但要提取基因组DNA, 周期相对较长、工作量大、成本较高(车永和, 2003; 甘四明等, 1998)。作为一种稳定的生化标记, 等位酶的表达遵循孟德尔定律, 试验取材和操作简单易行。聚丙烯酰胺垂直板凝胶电泳成本低、分辨率高, 但每次电泳的样品数及酶系统的种类相对较少; 水平切片淀粉凝胶电泳每次电泳的样品数多, 酶种类也较多, 效率较高, 但分辨率较低, 成本高。本试验把Amy、Fe、Lap采用聚丙烯酰胺电泳, Idh、Mdh、6 -Pgd、Skd采用淀粉凝胶电泳, 同时制备出聚丙烯酰胺凝胶和淀粉凝胶, 一次酶提液样品电泳就能测定7种等位酶, 整个试验时间快、成本较低、效率较高。虽然适合标记的等位酶种类相对较少, 但针对具体的物种选用合适的酶类, 作为一种基因表达产物的遗传标记方法, 等位酶在植物研究中的应用仍有不可替代的地位, 并发挥着独特的作用, 在栽培植物种质资源及树木群体遗传学研究上的应用也将越来越多。