土壤盐渍化是限制农林业生产和影响生态环境的一个非常重要的非生物胁迫因素, 而生物工程已成为改良植物适应盐渍化土壤最为理想和最有前途的方法, 受到世界各国政府的高度重视。国内外研究主要涉及盐胁迫条件下, 植物在损伤蛋白的降解与修复、钠离子运输、渗透调节物质合成、钙调蛋白和胚胎发育晚期丰富蛋白等方面发生的变化以及相关基因的克隆和转化, 这些研究成果大大推动了植物耐盐遗传改良的进程(Zhao et al., 2003)。迄今, 已克隆了数十个与盐胁迫诱导表达相关的基因, 证实了渗调物质如甜菜碱、脯氨酸、山梨醇、甘露醇等在高等植物耐盐方面有渗透保护与调节作用, 但这些物质单独对耐盐性的作用并不显著, 有的甚至与耐盐性无关(Flowers, 2004)。据报道, 盐胁迫对植物生长发育的主要危害表现为, Na⁺在细胞质中大量累积所导致的细胞生理生化代谢活动的抑制, 以及胞内离子平衡的破坏。提高植物耐盐性的一个重要方面就是降低胞质中的Na⁺含量。耐盐型植物把Na⁺排入液泡, 这样不但减少了胞质中Na⁺的含量, 同时排入的Na⁺也可作为一种离子渗透调节剂, 来克服高盐环境所引起的水分胁迫(Jeschke, 1984)。Na⁺排入液泡主要是通过液泡膜上Na⁺/H⁺ antiporters(NHX)来完成, 这种反向转运由液泡膜上H⁺-ATPase和H⁺-PPase所产生的跨膜H⁺梯度来驱动(Barkla et al., 1991)。

Na⁺/H⁺反向运输蛋白基因(NHX)是在细菌、植物和动物体内普遍存在的一类膜蛋白基因家族。第一个NHX基因由Sardet等(1989)从人体中分离出来, 而随后又相继分离出其他6个NHX成员并检测出它们具有Na⁺/H⁺反向运输的功能(Counillon et al., 2000)。借助人的NHX序列, 首先在模式植物拟南芥(Arabidopsis thaliana)中分离出了6个NHX基因, 序列分析显示其与人NHX基因的同源性较高(Yokoi et al., 2002)。在此基础上, 先后在主要农作物如水稻(Oryza sativa)、小麦(Triticum aestivum)、玉米(Zea mays)和陆地棉(Gossypium hirsutum)中以及果树如柑桔(Citrus reticulata)中分离出多个NHX成员。为了检测NHX₁转基因植株对盐的耐受性, 有研究者先后将AtNHX₁基因转入拟南芥、西红柿(Lycopersicon esculentum)、欧洲油菜(Brassica napus)中并对转基因植株进行了耐盐测定, 研究结果表明, 转AtNHX₁植株均可耐受200 mmol·L^-1 NaCl水溶液的浇灌, 并能正常生长、开花和结实(Apse et al., 1999; Zhang et al., 2001a; 2001b)。

NHX基因成员虽已从细菌、植物和动物中分离出来并进行了功能性检测, 但对于高度杂合、世代周期较长、树体高大, 对经济建设和环境保护具有重要作用的用材树种来说还未见关于该基因分离和检测的报道。因此, 分离用材树种NHX基因并对其产物的功能进行研究显得尤为必要。为此, 本研究以AtNHX₁和AtNHX₆的cDNA核苷酸序列为信息探针, 基于可利用的杨树EST数据库和毛果杨(Populus trichocarpa)全基因组测序结果, 通过电子杂交辅助的克隆技术, 从毛白杨(Populus tomentosa)形成层cDNA中分离得到2个NHX基因成员。在此基础上, 进行了杨树基因组Southern杂交分析以及组织特异性和盐诱导的差异表达分析。本研究为分离其他树种NHX成员以及阐明NHX的功能奠定了重要的基础。

1 材料和方法 1.1 植物材料

从河北省邱县4年生易县毛白杨雌株上取根部组织、韧皮部、形成层、未成熟木质部、成熟木质部、嫩叶和成熟叶片材料并置于液氮中冻存备用。

1.2 总DNA的提取

按Murray和Thompson (1980)描述的方法进行。

1.3 RNA提取和cDNA的合成

毛白杨根部组织、韧皮部、形成层、未成熟木质部、成熟木质部、嫩叶和成熟叶片材料总RNA的提取和cDNA的合成分别按RNeasy Plant Mini Kits (Qiagen, Inc., Valencia, CA, USA)和Clonetech试剂盒描述的方法进行。

1.4 电子杂交

以AtNHX₁和AtNHX₆ cDNA序列(GenBank注册号分别为NM-122597和AF490590)为信息探针, 将其输入瑞典和法国杨树EST数据库(Sterky et al., 2004)以及毛果杨全基因组数据库(Wullschleger et al., 2002)同源比较服务器进行BLASTN分析(Altschul et al., 1997), 筛选出同源性在75 %以上的ESTs和Contigs作为候选序列, 然后逐一将这些序列送GenBank核酸数据库检索, 后将这些序列进行整合拼接, 获得统计上完整的序列。

1.5 电子杂交探针制备

根据所得的EST重叠群整合序列, 在其可能的开放阅读框两端设计一对寡聚核苷酸引物: PtNHX₁F : 5′-ATG, GAT, CTT, AAC, GTG, AGT, TCA, A-3'PtNHX₁R : 5′-TCA, ATG, CCA, TTG, ATT, CGG, AG-3′ PtNHX₆F : 5′-ATG, CAG, ATA, TCA, CCG, GCA, GGA-3'PtNHX₆R: 5′-GGC, AAG, ATG, CAT, AAC, TGC, AGT-3′

应用25 μL DNA聚合酶链反应(PCR)体系, 以毛白杨形成层cDNA为模板, 加入2.5 μL 10×buffer, 1.8 μL 25 mmol·L^-1 MgCl₂, 1 μL 10 mmol·L^-1 dNTP, Taq DNA聚合酶1.0 U(以上试剂购自Promega公司), 100 nmol·L^-1引物各1 μL, 加适量双蒸水至25 μL。于94 ℃, 3 min→(93 ℃, 30 s →54 ℃, 30 s → 72 ℃, 1 min) 35个循环→72 ℃, 5 min热循环条件下, 扩增出长约1 700 bp的cDNA片段。

1.6 PCR产物的克隆、测序及计算机分析

将PCR扩增得到的目的基因片断回收后连接于pGEM-T上。连接产物转化大肠杆菌DH5ê, 筛选阳性克隆, 送上海联合基因公司测序。提取其质粒经酶切和PCR扩增来验证目的基因。应用DNAMAN4.0软件和CLUSTALX软件包程序推导出氨基酸序列并进行NCBI检索分析, 然后分别估算和预测推导蛋白质的分子量和等电点。

1.7 基因组DNA Southern blotting

用Dra Ⅰ、Hind Ⅲ、Xba Ⅰ、Nco Ⅰ、EcoRⅠ分别酶切10 μg毛白杨基因组总DNA。以Biotin标记的PtNHX₁和PtNHX₆基因的编码区为探针, 按照NortH₂SouthTM Biotin Random Prime Kit和North2South Chemiluminescent Hybridization and Detection Kit试剂盒说明进行Southern杂交。

1.8 杨树苗木NaCl处理

将1年生毛白杨苗木的根部浸入Hoagland营养液中, 含0~600 mmol·L^-1的NaCl浓度处理5 h后取其叶片进行ABA测定和RNA提取。

1.9 RT-PCR反应

依据PtNHX₁和PtNHX₆基因的编码区, 分别设计一对能够扩增出400 bp左右cDNA片段的引物, RTPCR引物序列如下:

PtNHX₁RTF : 5′-ATG, ATG, CCA, CAT, CAG, TGG, TGC-3'PtNHX₁RTR : 5′-CTC, AAT, GTC, CAG, GGC, ATC, CAT-3′

PtNHX₆RTF : 5′-ATG, CTT, GCA, GAA, GGT, CTT, GGC-3'PtNHX₆RTR: 5′-CCA, TGT, CCT, TCT, GGA, AGA, TCA-3′

以逆转录合成的cDNA第1链为模板。样品经94 ℃预变性3 min, 后进行94 ℃, 30 s, 54 ℃, 30 s, 72 ℃, 1 min, 28个循环, 72 ℃延伸5 min作PCR反应。

2 结果与讨论 2.1 毛白杨NHX同源cDNA的克隆及其结构特征分析

为了分离杨树NHX蛋白基因cDNA序列, 从拟南芥AtNHX₁和AtNHX₆ cDNA序列出发, 筛选杨树EST和毛果杨全基因组数据库。对于NHX₁, 共获得了5个候选序列TREE303998. b2、XXI 641 480. b1、TREE113285. b2、IPGC-040330.14875. C1和S 014G11.2.3P pR. ab1(图 1A), 而对于NHX₆, 共获得了3个候选序列UB52DPF09、YFS 34383. g2和V 045D01(图 1B), 这些候选的ESTs和Contigs与拟南芥的NHX同源性均在75 %以上, 应用DNAMAN4.0软件包ASSEMBLE程序拼接出较为完整的杨树NHX cDNA序列, 整合后的PtNHX₁和PtNHX₆的cDNA序列全长分别为1 635 bp和1 709 bp左右(图 1)。根据理论序列, 设计了能扩增出编码区全长的2对引物PtNHX₁F和PtNHX₁R以及PtNHX₆F和PtNHX₆R, 以毛白杨形成层总cDNA为模板进行PCR扩增。扩增产物经0.8 %琼脂糖凝胶电泳分离(图 2), 在大小分别约为1 635 bp和1 709 bp处各扩增出一条明亮的特异条带。将扩增的特异片段回收、纯化并与pGEM-T载体连接后克隆测序。测序结果表明, 克隆的这2个杨树NHX cDNA总长分别为1 635 bp和1 709 bp, 与理论上EST整合的核苷酸序列完全一致, 故将其命名为PtNHX₁和PtNHX₆。在PtNHX₁和PtNHX₆序列中, 基因内部含有完整的开放阅读框架, 大小分别为1 635 bp和1 581 bp, 可编码长度分别为544和526个氨基酸残基的蛋白质(基因注册号分别为AY660749和AY832912)。运用DNAMAN4.0软件估算推导的这2个蛋白质的分子量分别约为60.2 kD和57.6 kD, 其等电点分别为7.40和5.48。

2.2 cDNA序列查新、预测的蛋白质一级结构及其系统发育进化分析

将PtNHX₁和PtNHX₆基因序列与已公开的拟南芥基因序列进行同源比较, 发现它们与拟南芥的AtNHX₁和AtNHX₆ (GenBank注册号分别为NM-122597和AF490590)高度同源, 同源性分别为75 %和79 %。NCBI检索结果初步表明, PtNHX₁和PtNHX₆是林木中首次克隆的NHX蛋白基因。为了分析PtNHX₁和PtNHX₆蛋白质的一级结构特征, 将PtNHX₁和PtNHX₆ cDNA推导的氨基酸序列与拟南芥的AtNHX₁和AtNHX₆、水稻的OsNHX₁以及西红柿的LeNHX₁和LeNHX₂进行了同源比较和结构分析, 结果见图 3。PtNHX₁与拟南芥、水稻和西红柿的NHX₁蛋白质氨基酸序列高度同源, 同源性分别为79 %、76 %和70 %, 而PtNHX₆与AtNHX₆和LeNHX₂高度同源, 同源性分别为82 %和83 %, 但PtNHX₁和PtNHX₆蛋白质氨基酸同源性则很低, 仅为25 %。由图 3显示的NHX蛋白质一级结构可见, 无论PtNHX₁和PtNHX₆之间以及与拟南芥、水稻和西红柿NHX的同源性高与低, 它们都含有12个转膜区域(由Ⅰ, Ⅱ, Ⅲ …Ⅻ等表示)。在这12个转膜区域中, PtNHX₁与AtNHX₁、OsNHX₁和LeNHX₁以及PtNHX₆与AtNHX₆和LeNHX₂氨基酸序列高度相似, 特别是Ⅲ至Ⅻ相似度更高, 其中Ⅵ和Ⅶ被认为参与了Na⁺/H⁺反向运输活动(Yokoi et al., 2002)。

为了分析杨树PtNHX₁和PtNHX₆与其他生物NHX蛋白的系统发育进化关系, 利用ClustalX软件(Thompson et al., 1997)将在NCBI注册的拟南芥(AtNHX₁~6)、玉米(ZmNHX_1~6)、水稻(OsNHX₁、OsNHX₂和OsNHX₄)、小麦(TaNHX₁和TaNHX₂)、大麦(Hordeum vulgare) (HvNHX₁)、西红柿(LeNHX₁和LeNHX₂)、陆地棉(GhNHX₁)、柑桔(CrNHX₁)、欧洲油菜(BnNHX₁)、番薯(Ipomoea nil)(InNHX₁)、海蓬子(Salicornia europaea) (SeNHX₁)、盐地碱蓬(Suaeda salsa) (SsNHX₁)、老鼠(Mus musculus) (MmNHE₈)、果蝇(Drosophila melanogaster) (DmNHE₁)、酵母(Schizosaccharomyces pombe) (SpNHE)等17个物种共32个NHX蛋白氨基酸序列进行了序列排列, 后利用Treeview软件(Page, 1996)得到了这些NHX蛋白的系统进化树(图 4)。从图 4可见, NHX蛋白由极点向3个方向发生了进化, 其中有一分支在进化中占有主导地位, 共有24个NHX蛋白属于该类, 该类全部由植物NHX蛋白组成。研究结果初步表明, 占主导地位的这一分支的NHX蛋白主要附着在液泡膜上, 起Na⁺/H⁺反向运输的作用(Pascal et al., 2001), 而本研究中克隆的PtNHX₁就属于该类; 第2分支包括5个NHX蛋白, 该分支在进化过程的起始阶段就分成了2个小分支, 一为植物NHX蛋白, 另一为真菌酵母NHX蛋白。有研究表明这一类NHX蛋白与K⁺/H⁺反向运输的功能有关, 对Na⁺盐不太敏感(Venema et al., 2003); 第3个分支包括3个NHE蛋白, 它们均属于动物类NHE蛋白, 该类蛋白附着在动物体内质膜上, 对Na⁺/H⁺反向运输有重要作用(Venema et al., 2003)。

2.3 PtNHX₁和PtNHX₆基因的Southern杂交分析

利用能够酶切充分且探针内部不含有所用内切酶位点的限制性内切酶Dra Ⅰ、Hind Ⅲ、Xba Ⅰ、Nco Ⅰ、EcoRⅠ分别酶切10 μg杨树总DNA。以Biotin标记的PtNHX₁和PtNHX₆基因的编码区为探针, 按照North2SouthTM Biotin Random Prime Kit和North2South Chemiluminescent Hybridization and Detection Kit试剂盒说明进行Southern杂交分析, 得到如图 5所示的图谱。由图 5可见, 对于PtNHX₁基因, 用Dra Ⅰ、Hind Ⅲ、Xba Ⅰ酶切杨树总DNA时, Southern杂交分析均能得到4条杂交信号条带, 而对于PtNHX₆基因, 用Dra Ⅰ、Nco Ⅰ、EcoR Ⅰ酶切时, 能得到1~4条杂交信号带, 考虑到树木属于高度杂合类型的物种, 因此, 可以推测PtNHX₁和PtNHX₆均为低拷贝基因(或有一些高度同源的基因), 在杨树基因组中以1~4个拷贝形式存在。

2.4 PtNHX₁和PtNHX₆基因的组织表达谱分析

采用RNeasy Plant Mini Kits试剂盒分别提取杨树根部、韧皮部、形成层、未成熟木质部、成熟木质部、嫩叶和老叶组织的总RNA并用紫外分光光度计定量分析提取的各个组织的RNA含量。在此基础上, 用2 μg总RNA为模板(图 6A), 按照Clonetech试剂盒描述的方法进行RNA反转录反应分别得到各个组织部分的第1链cDNA。为了检测转录的cDNA的浓度和质量情况, 利用在植物体内广泛存在的杨树泛素结合酶(Ubiquitin Conjunction Enzyme)基因序列设计的引物来扩增cDNA模板, 结果见图 6B, 可见, 以这7个组织材料的cDNA模板扩增的杨树泛素结合酶基因片段的丰度基本一致, 可用于PtNHX₁和PtNHX₆基因的组织表达谱分析。

依据PtNHX₁和PtNHX₆基因的编码区, 分别设计一对能够扩增出400 bp左右的cDNA片段的引物PtNHX₁RTF和PtNHX₁RTR, 以及PtNHX₆ RTF和PtNHX₆RTR, 以逆转录合成的cDNA第1链为模板。样品经94 ℃预变性3 min, 后进行94 ℃30 s, 54 ℃30 s, 72 ℃1 min, 28个循环, 72 ℃延伸5 min作PCR反应。反应产物经0.8 %琼脂糖凝胶电泳分离后, 用EB染色后得到如图 6C和D所示的结果。PtNHX₁和PtNHX₆基因在杨树根、茎和叶片中均有表达, 但其表达模式稍有不同: PtNHX₁在根部、形成层、未成熟木质部、成熟叶和嫩叶中均高度表达, 在韧皮部和成熟木质部中有少量表达; 而PtNHX₆在根部、成熟叶和嫩叶中表达丰度较高, 在韧皮部、形成层、未成熟木质部表达丰度较低, 在成熟木质部中表达丰度极低。

2.5 PtNHX₁和PtNHX₆基因的调控表达

为了检测PtNHX₁和PtNHX₆基因对NaCl的诱导是否具有调控表达的作用, 且有报道当植物在盐胁迫处理时, 植物叶片对盐的反应较为敏感, 可积累较多的盐分(Yokoi et al., 2002)。因此, 本研究将1年生杨树苗的根部浸入Hoagland营养液, 溶液的NaCl浓度在0~600 mmol·L^-1设6个梯度(100, 200, 300, 400, 500, 600 mmol·L^-1)分别处理5 h后取其叶片进行ABA测定和RNA提取。与PtNHX₁和PtNHX₆基因的组织表达谱分析一样, 分别提取对照和不同NaCl浓度处理后的叶片总RNA并进行定量分析, 用泛素来检测反转录后所得第1链cNDA的质量和数量(图 7A、B)。在此基础上, 利用RT-PCR检测了PtNHX₁和PtNHX₆对不同浓度NaCl溶液处理后的差异表达情况, 结果见图 7C、D, 可见PtNHX₁和PtNHX₆基因均受盐诱导表达, 当溶液中NaCl浓度在100~400 mmol·L^-1范围内, 随着盐浓度的提高, PtNHX₁和PtNHX₆基因的表达丰度逐渐增强, 但超过400 mmol·L^-1后, 其表达丰度均有所降低, 这与所测定的叶片ABA含量相匹配(图 7), 但PtNHX₆对NaCl的诱导表达不如PtNHX₁敏感。因此, 该研究初步表明, 所分离的PtNHX₁和PtNHX₆均为受NaCl胁迫诱导的基因。