花楸树(Sorbus pohuashanensis)为蔷薇科苹果亚科花楸属植物, 落叶小乔木, 树高达8 m。主要分布在我国东北、华北, 朝鲜北部, 俄罗斯远东地区也有分布(周以良, 1986; 周德本, 1986)。花楸树春季满树银花, 夏季羽叶秀丽, 秋、冬季红果满枝, 是一种未被充分开发利用的优良绿化树种。在生产实践中, 一般采用播种的方法繁殖花楸树苗木, 但由于花楸树数量稀少, 常单株散生于较高海拔的山地暗针叶林、山谷杂木林及河岸等地, 存在采种母树不足、种子收集困难(出种率1%左右)(于春江等, 1998)、种子发芽率低(高慧等, 1997)等问题。国外有人对欧洲花楸(S.aucuparia)种子的后熟、休眠和发芽, 鸟类取食对朝鲜花楸(S.commixta)以及动物内脏的消化作用对欧洲花楸种子发芽的影响, 温度对S.glabrescens种子发芽和休眠的影响等做过报道(Oster et al., 1987; Taylor et al., 1987; Basharuddin et al., 1993; Yagihashi et al., 1998; Paulsen et al., 2002)。结果表明, 花楸的果肉和果汁均明显抑制种子的发芽。自然条件下, 大部分花楸种子没有鸟或动物的提前取食不发芽(Yagihashi et al., 1998)。人工播种对种子的处理强调冷、湿两种条件, 温度超过5℃以上则种子停止发芽。国内对花楸树繁殖的研究集中在播种繁殖研究上(姜雁等, 1998; 梁华等, 1999; 吕威等, 2001), 人们在生产实践中也积累了一些关于种子采集、调制、育苗地选择及整地作床、播种(包括催芽、播种时间和方法)、抚育管理、病虫害防治、移栽、苗木生长等方面的一些经验; 但由于花楸树播种育苗技术复杂, 不易掌握, 实生苗生长周期长, 成型慢, 所以目前市场上花楸树苗木生产供不应求。

本研究对花楸树种子进行了种子生活力测定、解剖学观察、种皮障碍性检验、内源抑制物质提取和生物测定以及种子休眠解除和萌发条件等方面的研究, 为更好地解除花楸树种子休眠、促进种子萌发提供理论依据, 为生产实践中缩短花楸树种子催芽处理时间、加快种子繁殖速度奠定基础。

1 材料与方法 1.1 材料

花楸树种子于2003年9月下旬采自黑龙江省伊春五营国家森林公园内的石塘地中。果实在水中浸软后用手搓洗去果皮和果肉, 种子用水选法撇去浮沫后, 于室温下自然干燥并吹去碎片和空粒, 挑选出饱满种子装入密闭的塑料袋内, 保存在0~5℃的冰箱中。种子平均含水量为(5.71 ±0.153)%(在安全含水量9%~10%以下), 千粒质量为(2.385 ±0.009 5)g, 生活力测定为88.89%(参照国际种子检验协会(ISTA 1996)规定的方法, 用5 g·L^-1氯化三苯基四唑溶液(pH=6.8), 于35℃下染色18 h后统计种子的染色情况)。

1.2 方法

1) 种子萌发试验  取饱满种子用水浸泡2 d(每天换水1次), 5 g·L^-1 KMnO4搅拌消毒2 h后冲洗干净, 于光照(光照16 h黑暗8 h, 光强2 000~3 000 lx)、25℃恒温条件下直接在培养皿内的发芽床上萌发。发芽床的制备:预先用70%的酒精擦拭培养皿消毒, 待酒精挥发后在培养皿内铺上一层脱脂棉, 上面覆盖一层滤纸, 用蒸馏水把滤纸和脱脂棉充分浸湿, 然后再把消毒后的种子摆放在滤纸上。每日定时补充水, 记录种子的绝对发芽率。试验设3个重复, 每重复100粒饱满种子。

2) 种子解剖观察  为使种皮变软, 便于解剖, 用清水浸泡饱满的花楸树种子48 h后在实体解剖镜下观察胚的发育状况。共剥取100粒种子。

3) 种皮对种子萌发的影响  种皮机械障碍的测定:取完整种子和去皮种子, 70%乙醇消毒30 s后再用3% NaClO消毒10 min, 分别于光照(光照16 h黑暗8 h, 光强2 000~3 000 lx)或黑暗、25℃恒温条件下进行无菌萌发试验。记录种子的绝对发芽率。培养基:MS +20 g·L^-1蔗糖+6 g·L^-1琼脂(pH=5.8)。种皮透水性的测定:取刺破种皮和种皮完整的种子各2 g, 放入100 mL烧杯中用水浸泡, 每隔12 h取出种子, 将种子表面水用滤纸吸干后称重, 直至种子重量不发生变化为止, 画出种子吸水曲线。种皮透气性测定:取刺破种皮和种皮完整的种子各2 g, 25℃下水浸泡0.5 h, 利用微量呼吸检压仪测量种子水浸前后的吸氧速率(王晶英等, 2003)。

4) 抑制物的生物测定  参考王小平等(1998)的方法, 取饱满种子的种胚、种皮和完整种子各2 g, 研磨后, 分别用10 mL蒸馏水、80%甲醇溶液于0℃下静止提取48 h。滤除残渣, 水提取液直接用蒸馏水定容至9mL。80%甲醇提取液于80℃下减压浓缩后, 再用蒸馏水定容至9 mL。分别取上述浸提液0.5、1和1.5 mL, 用蒸馏水定容至2 mL, 制成浓度为0.05、0.1和0.15 g·mL^-1的溶液, 倒入直径6 cm的培养皿中(培养皿内预先铺设一层滤纸), 每皿放30粒白菜种子(千粒质量:2.321 5 g)进行发芽试验, 以同体积蒸馏水为对照, 每种处理3次重复。光照(光照16 h黑暗8 h, 光强2 000~3 000 lx)、25℃条件下48 h后记录白菜种子的发芽率, 测量胚根的长度, 记录胚根长度大于4 mm的种子数量。

5) 解除种子休眠的试验  ①去子叶或断胚根处理种子:取饱满种子, 清水浸泡4 d, 消毒(70%乙醇30 s+3%NaClO 10 min), 无菌水冲洗干净后在无菌操作台上处理为:A去皮的完整胚; B切去两片子叶的胚; C切去胚根的胚。然后接种到培养基上进行光照培养, 培养基和光照培养条件同3)。记录胚的萌发情况。②低温沙藏试验:饱满种子用清水浸泡4 d, 5 g·L^-1KMnO₄消毒后, 混沙(含水量大约80%, 种沙体积比为1:3), 于0~5℃催芽, 定期通气和保持沙子湿润。记录种子裂嘴时间和裂嘴率。种子裂嘴, 胚根伸出即视为萌发。③外源激素和稀盐溶液对种子休眠与萌发影响:配制50、100、150和200 mg·L^-1的赤霉素GA₃、细胞分裂素6-BA和脱落酸ABA, 以及浓度为1%、2%、4%和6%(W/V)的KNO₃溶液, 用这些不同浓度的激素和KNO₃溶液浸泡花楸树种子, 时间设为24、48和72 h 3个梯度, 然后用清水冲去残液, 5 g·L^-1 KMnO₄搅拌消毒2 h后用无菌水冲洗干净, 于光照(光照16 h黑暗8 h, 光强2 000~3 000 lx)条件下25℃恒温、0~5℃低温弱光和变温(25℃恒温10 d, 再于0~5℃低温催芽)3个条件下进行发芽试验。记录花楸树种子的绝对发芽率。发芽床的制备同1)。

6) 数据处理和统计分析  试验数据利用DPS(唐启义等, 2002)数据处理系统进行方差分析和Duncan多重比较, 图中和表中的数据均为3次重复的平均值, " ±"之后为数据的标准偏差。

2 结果与分析 2.1 种子萌发试验

试验持续8个多月, 仅2号培养皿在培养89 d和121 d时各有1粒种子萌发; 3号培养皿在培养96 d时有1粒种子萌发, 3次重复的平均萌发率为1%±0.01。且均为子叶突破种皮后变为绿色, 胚轴和胚根未见伸长(图版Ⅰ-1)或仅下胚轴伸长(图版Ⅰ-2)。在进一步的移栽驯化中(栽培基质为草炭土:蛭石=1:2(V:V); 光照16 h黑暗8 h, 光强2 000~3 000 lx; 温度为25℃)不能成活。

2.2 胚的发育状况

共观察了100粒饱满的种子。结果100%的种子具有完全的胚结构:两片充满胚腔的子叶、具胚芽、胚轴和裸露的胚根(图版Ⅰ-3、4), 说明花楸种子胚在形态上是发育完全的, 种子休眠的原因不是由于胚的形态后熟。

2.3 种皮对种子萌发的影响

1) 种皮的机械障碍作用  试验时间从3月11日至6月2日(共83 d, 继代间隔期为30 d)。光照条件下, 去皮种子的萌发率为6%, 而完整种子的萌发率为3%(表 1)。暗培养的去皮种子在培养最初7 d中有2%萌发, 然后转移到光下进行培养。而暗培养的完整种子, 萌发率则为零。萌发的去皮种子在近3个月的培养中表现出较一致的特征, 都是下胚轴过分伸长且粗壮、上胚轴不伸长或羽状复叶簇生、植株矮化(图版Ⅰ-5、6、7、8)。这表明, 种皮对种子萌发的机械障碍作用不大, 即使胚不受种皮的机械阻碍, 产生的幼苗也不能正常生长。

2) 种皮透水性的测定  由种子吸水曲线(图 1)可以看出:浸泡12 h, 刺破种皮种子和种皮完整种子的吸水量急剧增加, 完整种子的吸水量达到70.08%, 而刺破种皮的种子吸水量则达到83.41%;浸泡24 h时, 种子吸水量增加缓慢, 但种皮完整种子吸水量的增加仍达到显著水平(p < 0.05);浸泡24 h以后, 种皮完整种子吸水量继续增加, 而刺破种皮种子的吸水量却略降低。这可能是破裂的种皮失去对种子的保护作用, 而细胞外水势又高于细胞内水势, 细胞无限制吸胀, 导致质膜渗漏增加的结果。浸泡36 h以后, 种皮完整种子和刺破种皮种子的吸水都达到饱和状态(如图中字母所示:随着时间的延长, 吸水量差异不显著)。这表明种皮对种子的透水性障碍不大。

3) 种皮透气性的测定  种皮完整的种子和刺破种皮的种子在浸水前后的平均吸氧速率分别是53.28和211.56 μL·g^-1h^-1及72.498和265.74 μL·g^-1h^-1。这表明种皮对种子的呼吸作用有一定的阻碍; 在浸水之后种皮完整种子和刺破种皮种子的吸氧速率都有所增加, 且种皮完整种子吸氧速率增加的幅度比刺破种皮种子的吸氧速率增加的幅度大(种皮完整种子吸氧速率增加了36.2%, 刺破种皮种子则为20.9%), 说明花楸树种皮透气性良好, 种子休眠不是因为种皮透气性差。

由以上分析可知, 种皮对花楸树种子萌发的影响不是花楸树种子休眠的主要原因。

2.4 种皮和胚的浸提液对种子萌发的抑制作用

花楸树完整种子、种皮和胚的提取液对白菜种子萌发的抑制作用见表 2。随着各种提取液浓度的增加, 提取液对白菜种子萌发的抑制作用增强:白菜种子的萌发率下降, 萌发后胚根长度缩短, 并且这种差异达到极显著水平(p < 0.01)。80%甲醇提取液对白菜种子萌发的抑制作用明显高于蒸馏水提取液, 0.1和0.15 g·mL^-1浓度的种皮和种胚的甲醇提取液完全抑制了白菜种子的萌发。这说明花楸种皮和种胚内溶于有机溶剂的物质可能对种子休眠起更大作用。

2.5 种子休眠的解除

1) 去子叶和断胚根解除种子休眠  外植体接种3 d后, 与培养基接触的子叶先变绿, 离培养基较远的子叶发展趋势是延迟变绿或仅仅增大并不变绿。只有两片子叶全变绿的胚才有可能萌发成幼苗。仅有一片子叶变绿的胚在长达数月的培养中会逐渐褐化。完整胚、去两片子叶的胚和断胚根的胚3种外植体, 在培养20 d时两片子叶全变绿的比例依次是36.25%、18.75%和52.5%, 培养34 d时增加为70.77%、71.79%和86.25%。而3种处理下胚的萌发率在培养20 d和培养34 d时是一样的, 完整胚、去两片子叶的胚、断胚根的胚的萌发率分别为1.5%、2.5%和2.5%。对种胚进行去子叶和断胚根处理可以略微提高胚的萌发率, 但差异不显著(p >0.05)。

2) 低温沙藏解除种子休眠  生产实践中常用雪藏或低温沙藏的方法进行花楸树种子的催芽, 一般是在种子裂嘴(露白)率达到30%左右即进行播种(Razumova, 1987; 姜雁等, 1998)。本研究中, 0~5℃混沙处理的种子在沙藏43 d时开始露白(重复处理2和3各有1粒种子露白), 沙藏3个月时, 花楸树种子裂嘴(露白)率为14.89%。沙藏255 d时(8个多月), 平均裂嘴率为27.32%。将低温混沙处理的花楸树种子播种在经过消毒的基质中(草炭土:蛭石=2:1(V:V)), 上盖0.5 cm厚的消毒细土, 浇透水, 于温室(17~22℃)中密封培养。3~4 d开始出苗, 出苗率20.16%。出苗后揭开培养盒的盖, 通气, 培养40 d时幼苗存活率为73.08%。经过0~5℃混沙处理的花楸树种子能够正常萌发并长成正常的幼苗(胚根、胚轴均伸长, 两片子叶展开并变为绿色), 说明低温混沙处理有利于解除花楸种子的生理休眠。

3) 外源激素和稀盐溶液对种子休眠与萌发影响  试验持续时间为3个月, 采用GA3、6 -BA、ABA和KNO3四种物质处理种子, 结果表明, 不同处理间的绝对发芽率差异呈极显著水平(F_0.01=14.954 >1.302, p < 0.01)。在本试验中200 mg·L^-16 -BA处理24 h后于0~5℃低温弱光条件下层积, 种子的裂嘴率最高为31.56%。这个结果与水浸种2 d、光照(光照16 h黑暗8 h, 光强2 000~3 000 lx)、25℃恒温条件下种子在持续8个多月内的发芽率(发芽率为1%)相比差异显著(F_0.05=17.32 >7.71, p < 0.05)。GA₃和KNO₃处理对种子发芽率的影响不如6 -BA效果好。ABA则完全抑制了花楸树种子的萌发, 种子的发芽率均为0%。在相同激素处理(200 mg·L^-1BA处理24 h)、不同温度和光照条件下, 种子萌发的启动时间不同, 0~5℃低温弱光虽然延长了种子萌发的启动时间, 但却能极显著增加种子的发芽率(F_0.01=14.256 >5.143, p < 0.01), 促进种子完成生理后熟, 解除种子的生理休眠。而先暖后冷的变温处理(种子直接在25℃光照条件下处理10 d后再0~5℃低温层积)既不能提高花楸树种子发芽率又不能缩短种子萌发所需要的启动时间, 对解除花楸树种子的休眠没有促进作用(表 3)。

3 讨论 3.1 休眠原因与休眠的解除

种子的休眠与萌发是植物为适应环境(气候变化、温度差异、水分条件等种种因素)保持自身繁殖发展而形成的一种生物学特性, 具有重要的意义。因此, 大多数温带和寒带植物的种子在夏末和秋季散落之后, 尽管温度、湿度和光照均适合于种子发芽, 仍保持休眠, 直到来年春季才萌发。自然界中花楸树虽然分布很广, 但仅单株散生在较高海拔的山地暗针叶林(云杉、冷杉林)等地, 数量稀少, 是寒温性针叶林特有的伴生阔叶树种(周以良, 1986)。为了适应北方冬天的寒冷气候, 花楸树不但耐寒力强而且其种子具有深度休眠的特性, 并且花楸树的果肉和果汁均具有抑制种子萌发的物质。自然条件下, 未被鸟类取食的花楸树种子, 因为被果肉包裹, 在第1年的春天不能萌发, 夏天果肉腐烂后, 种子在第2年的春天才能萌发。而实际上, 大多数种子在第2年的春天并没有萌发, 是因为它们在第1年的夏天里失去了活力。可见, 自然条件下, 花楸树种子不经过鸟类或动物的取食不能发芽(Yagihashi et al., 1998)。正是由于花楸树的这种休眠特性, 导致野生花楸树的数量稀少。通过本文的研究, 推断生理休眠是花楸树种子休眠的主要原因。

本研究中, 去除种皮的花楸树种胚经过离体培养并不能很好地解除花楸树种子的休眠, 且产生矮化的幼苗, 这一特征与蔷薇科其他树种相同(徐本美等, 1994; 徐本美, 1995)。低温层积处理是打破种子生理休眠常用的方法(董丽芬等, 2003)。0~5℃混湿沙处理有利于打破花楸树种子的休眠, 促进种子的萌发。但本文中低温层积后的暖温(17~22℃)条件下播种并没有增加花楸树种子的发芽率(播种后的出苗率仅为20.16%), 可能是由于17~22℃的发芽温度导致了种子的二次休眠(Lenartowicz, 1988)。同样, Taylor等(1987)认为20℃和30℃的交替处理会导致S.glabrescens种子的二次休眠, 1~3℃低的发芽温度对发芽有利。本文中对花楸树种子进行先暖后冷的变温处理, 试验结果证明, 暖层积不会提高发芽率, 这与前人的研究结果相同(Zentsch, 1970)。

众所周知, ABA对种子休眠有调节作用, 这一调节作用受环境和种子自身对ABA合成、代谢与反应能力的影响(孙果忠等, 2004)。本研究中外源细胞分裂素和低温结合处理对打破花楸树种子休眠具有很好的效果, 在层积3个月时种子的裂嘴率达到31.56%(达到现在生产上的播种要求); 而外源ABA则完全抑制了花楸树种子的萌发。推测ABA可能对花楸树种子的休眠起重要的作用。

3.2 种胚不同部位的休眠程度分析

结合2.1和2.3的结果分析, 我们发现花楸树种胚不同部位的休眠程度不同。子叶在突破种皮后暴露在光下以及离体胚在光下培养中, 子叶均可以扩展并且形成叶绿素后变成绿色, 并且离体培养胚的下胚轴过分粗壮和伸长, 说明花楸树成熟胚的子叶和下胚轴的休眠程度较浅; 离体培养胚的上胚轴不伸长、植株矮化, 胚根不伸长, 说明成熟胚的上胚轴和胚根的休眠程度较深, 在上胚轴和胚根中存在代谢缺陷。低温沙藏可以获得子叶、胚轴和胚根正常伸长的幼苗, 说明此时休眠已经解除。对胚进行去两片子叶和断胚根处理可以略微提高胚的萌发率, 说明在子叶和胚根中可能存在抑制剂, 能抑制上胚轴和胚根的生长。在荚蒾(Viburnum trilobum)、欧洲卫茅(Euonymus europaeus)、欧洲白蜡(Fraxinus excelsior)、榛(Corylus avellana)、桃(Prunus persica)和苹果(Malus sylvestris)等种子的休眠研究中也有类似的结果, 切除一片或两片子叶可以解除胚轴的休眠(杨期和等, 2003)。

此外, 虽然利用激素能够促进花楸树种子萌发, 但成本较高, 并且对种子萌发后形成幼苗的生长状况还不清楚, 还需要进一步研究, 以筛选出解除花楸树种子休眠、提高种子发芽率的既经济又有效的方法。