自从Oku(1980)首次提出细菌在松材线虫病中的致病作用以来, 很多学者对松材线虫病的真正致病原因进行了大量的试验。曹越等(1996)首先提出了松材线虫不能产生致萎毒性物质。随后, 赵博光等(2000)、谈家金等(2001)、洪英娣等(2003)和Han等(2003)进行了大量的接种试验, 证明了无菌松材线虫对黑松(Pinus thunbergii)愈伤组织及无菌苗并没有致病作用, 只有当无菌松材线虫与致病细菌混合接种时, 才能对愈伤组织及无菌苗产生致病力。据此, 提出了松材线虫病真正的病原是松材线虫携带的致病细菌。虽然利用愈伤组织和尚未完全木质化的松树幼苗在一定程度上可以反映松材线虫的致病性, 但在自然界松材线虫病危害的均是完全木质化的多年生大树, 所以要真正反映无菌松材线虫的致病性, 必须要在完全木质化的大树上进行检验。本次试验在野外采用相对无菌的接种方法, 测定了无菌松材线虫对10年生黑松的致病性。

1 材料与方法 1.1 松材线虫的分离、无菌化处理与培养

松材线虫来源于南京市铁心桥镇自然感病死亡的15 ~ 20年生的马尾松(Pinus massoniana)。分离到的松材线虫经纯化以后, 先经体积比为3 %的H₂O₂处理5 min, 无菌水换洗3次, 再用体积比为0.05 %的硫酸链霉素和硫酸庆大霉素(南京制药厂)混合液处理5 ~ 6次, 每次处理5 min, 不断振荡, 避免线虫沉入离心管底部, 使抗菌素与线虫充分混合。每次处理后均用无菌水换洗3次, 处理后的线虫经NB培养基平板检验确系无菌后, 在超净工作台上于解剖镜下挑取雌、雄成虫各10条, 放在黑松愈伤组织上, 25 ℃黑暗培养, 后一直在黑松愈伤组织上继代培养。接种时用无菌水将线虫洗下, 调节线虫浓度直接使用。

1.2 野外接种

试验对象为南京伊刘苗圃的10年生黑松, 采用树干打孔注射法接种。先用70 %的酒精棉擦拭接种部位, 再用灭菌刀片削去树皮, 然后用灭菌的打孔器(ϕ0.5 cm)对露出的木质部打出深度约为1 cm、开口斜向上方的圆孔, 用灭菌的滴管吸取无菌松材线虫悬浮液500 μL(含线虫10 000条)滴加到圆孔中, 用无菌的棉花球封住孔口, 在孔口边缘处涂抹抗菌素, 然后用胶带缠绕接种部位, 胶带外边再加涂一层抗菌素, 防止细菌侵入。操作过程中, 用经70 %酒精浸泡过的塑料薄膜在树冠下部围一空间, 并在接种区域摆放2盏燃烧的酒精灯, 以减轻操作过程中的污染。整个操作过程要求动作迅速, 尽量减轻因接种部位暴露时间过长而造成细菌污染。无菌松材线虫共接种8棵松树, 以未经处理的自然松材线虫为对照, 接种3棵松树。

1.3 接种后的再分离 1.3.1 木质部的线虫分离及细菌检验

等到接种未经处理的自然松材线虫的松树(对照株)枯死时, 对所有接种的松树进行取样。未发病的松树采集任意枝条, 已经发病的松树采集其发病枝条进行分离检验。采样时用灭菌的剪刀迅速剪下枝条, 在切口处涂抹抗菌素, 并用胶带缠绕, 防止细菌侵入。采回的枝条做如下2种处理:一部分用于线虫分离, 将枝条的皮剥去, 劈成小木片后, 用浅盘法分离松材线虫并计算每克木材中的线虫数; 一部分用于细菌检验, 剥去树皮, 在超净工作台上用70 %的酒精棉擦拭消毒, 然后用灭菌的解剖刀削去边材, 取木质部, 削成20 mm ×10 mm的薄片放在NB培养基平板上, 28 ℃下黑暗培养, 2 ~ 3 d后观察细菌分离结果。

1.3.2 线虫的无菌检验

为进一步确定松枝条内的线虫是否携带细菌, 进行线虫的无菌检验。剥去树皮, 在超净工作台上用70 %的酒精进行表面消毒, 将木质部削成薄片, 直接放在长满灰葡萄孢(Botrys cinerea)的PDA平板上。为使其内部的线虫易于爬出, 在木片上滴加少许无菌水, 25 ℃下培养。待线虫从木片中爬出并取食灰葡萄一段时间后, 挑取线虫连同PDA培养基直接放在NB培养基平板上检验, 28 ℃黑暗培养, 2 ~ 3 d后观察是否有细菌菌落长出。

2 结果与分析 2.1 发病情况

2001年9月进行野外接种, 2002年8月检查发病情况(表 1)。无菌松材线虫接种的8株黑松中, 1株完全枯死, 2株部分枝条表现枯萎症状, 5株完全健康; 作为对照的接种未经处理的自然松材线虫的3株松树全部枯死。

2.2 再分离结果

对所有接种株的再分离结果显示(表 1), 只有1株健康松树体内未分离到松材线虫。接种无菌松材线虫的8株松树中, 发病的3株松树体内均分离到线虫和细菌, 线虫经检验体表携带大量细菌; 另外5株表现正常的松树体内均未分离到任何细菌, 有4株分离到松材线虫, 分离到的线虫经检验没有携带细菌, 均为无菌线虫。作为对照的接种自然松材线虫的3株松树体内均分离到大量的线虫和细菌, 线虫经检验携带大量细菌。

接种无菌松材线虫的8株松树中, 完全枯死的1株其体内线虫量数最多, 木材样品含虫量为2 606条·g^-1; 部分枝条枯死的2株松树中, 1株样品含虫量为330条·g^-1, 另1株为53条·g^-1; 而树体内含有线虫却没有表现症状的4株松树中, 样品平均含虫量为47条·g^-1。接种自然松材线虫完全死亡的3株松树体内线虫平均含量为2 206条·g^-1。

3 讨论

以前进行的无菌松材线虫接种试验, 均是在室内用无菌黑松幼苗作为接种对象的, 虽然试验取得了一致结果, 证明了无菌松材线虫不能引起松苗萎蔫, 但因所采用的松苗没有完全木质化, 与自然界感病松树差异较大, 所以不得不对试验结果的可靠性提出质疑。本次试验将无菌松材线虫接种到野外10年生黑松上, 其过程与自然界有很大的相似性, 能真实反映自然界的情况。

从本次试验的再分离结果看, 凡是木质部有细菌存在的接种株, 均已表现了典型的枯萎症状; 而木质部没有细菌的植株, 尽管其内部有松材线虫存在, 植株也不表现症状。这一结果与室内试验结果基本一致, 也同样说明细菌的存在是松树发病的关键。

Tamura(1983)用无菌松材线虫接种3年生黑松, 但接种结果和本试验几乎相反, 接种株大多发生了枯萎。Kawazu等(1997; 1998)对Tamura的试验结果指出了异议, 认为Tamura试验所用的黑松苗并不是无菌苗, 致病的细菌在树体表面普遍存在, 当无菌线虫侵入松苗时重新感染上这些细菌, 从而又获得致病性。在进行本试验时, 也考虑到了这方面因素。在接种操作时, 尽量快速并进行了一些防护措施以避免污染。但毕竟是在野外操作, 接种对象又是10年生的大树, 不可避免地会造成一些污染, 这也可能是3株接种无菌松材线虫的松树发生枯萎的原因。本次试验接种无菌松材线虫的处理中, 有3株松树表现了枯萎症状。从表面上看, 似乎接种无菌松材线虫也同样能够致病, 但经检验这3株松树的木质部均有大量细菌存在, 其体内的松材线虫也都是携带细菌的线虫。无菌的松材线虫, 如何变成了携带细菌的线虫?可能正如Kawaza等提出的:这种致病的细菌在自然界中普遍存在, 细菌可以在接种时或后来通过松树体上其他伤口进入松树体内。

从线虫和细菌的再分离结果看, 凡是发病的植株, 其体内都有细菌存在, 并且线虫的数量较多; 而健康植株体内不存在细菌, 线虫数量也较少。这一结果可能有截然不同的2方面解释:一是松树是否发病与其体内的线虫数量有关, 没有发病的松树是由于线虫没有繁殖到一定数量, 待树体内的线虫达到一定量后, 松树就会出现枯萎症状。也就是说, 松树的枯萎与细菌无关, 而与线虫数量有关。二是松材线虫的繁殖与细菌的存在有关, 细菌和线虫具有一定的共生关系, 细菌的存在有利于线虫的繁殖。所以, 存在细菌的枯萎植株内, 线虫数量也多。这2方面的解释, 似乎均有一定的道理, 但笔者认为后者更有说服力, 原因有3 :其一, 凡是松材线虫病致死的松树, 其木质部内均能分离到细菌(Han et al., 2003); 其二, 作者在松材线虫培养过程中发现, 凡携带细菌的松材线虫繁殖速度比无菌的松材线虫快得多; 其三, 本研究中的3号接种株, 树体内有细菌存在, 但其木质部内线虫数量并不很多, 却已表现了枯萎症状。