以抗微生物为导向, 从植物资源中寻找高效、低毒、广谱、抗耐药等优越活性的新型抗微生物先导化合物, 依然是植物化学研究的基本内容之一。黑刺菝葜(Smilax scobinicaulis), 又名短梗菝葜, 是百合科菝葜属的一种攀援状木质藤本, 其根茎在我国北方作威灵仙和金刚刺入药已有多年历史, 具除风湿、活血解毒、镇惊息风和抗癌等功效, 临床用于治疗风湿性腰腿病、肠炎、疮疖、癌肿等病症(江苏新医学院, 1996)。其根茎含有丰富的甾体皂苷和黄酮类化合物(刘俊彦等, 2000); 但其抗菌活性成分目前尚未见报道。本论文对黑刺菝葜中甾体皂苷成分进行了抑菌活性研究, 希望从中筛选和分离得到抑菌活性物质, 为阐述其药理作用, 深入研究和开发黑刺菝葜资源奠定基础。

1 材料与方法 1.1 仪器与试剂 1.1.1 仪器

渗漉筒(自制), SENCOR₅₀旋转薄膜蒸发仪(上海申声科技有限公司), ZF-2型三用紫外分析仪(上海市安亭电子仪器厂), LS-B50L型立式压力蒸汽灭菌器(上海医用核子厂), LRH-250A生化培养箱(广东省医疗器械厂), YJ-875A医用净化工作台(苏州伟拓净化设备技术有限公司), INOVA-400MHz型超导核磁共振仪(美国Varian公司), ZAB-HS型质谱仪(英国VG公司), Equinox-55FT红外分光度计(德国布鲁克公司), DU-7紫外可见分光光度仪(美国贝克曼公司); XRC-1型显微熔点仪(北京泰克仪器公司), 温度计未校正。

1.1.2 试材及试剂

供试材料为生长于太白山的百合科菝葜属植物黑刺菝葜的根茎, 2000年10月采集。大孔树脂D101型(天津农药股份有限公司、树脂分公司生产), 色谱用硅胶(100~200目, 200~300目) (由青岛海洋化工厂生产), Sephadex LH-20(瑞典Amersham Biosciences公司产品), ODS-A进口原装(购自北京绿百草科技发展有限公司), 反相薄板(德国MERCK公司产品)。

1.1.3 供试菌种

供试菌种包括6种细菌和5种真菌, 其中细菌为金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus), 枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、蜡状芽孢杆菌(B. cereus)、大肠杆菌(Escherichia coli)、普通变形杆菌(Proteus vulgaris)、巨大芽孢杆菌(B. megathrium); 真菌为黄曲霉(Asperhillus flauus)、黑曲霉(Asperhillus niger)、康氏木霉(Trichoderma koningii)、青霉(Penicillium sp.)、绿色木霉(T. lignorum)。

1.1.4 病菌培养基

牛肉膏蛋白胨琼脂培养基(培养细菌):牛肉膏3 g, 蛋白胨10 g, 氯化钠5 g, 琼脂18~20 g, 水1 000 mL, pH 7.2~7.4;马铃薯琼脂培养基(培养真菌):马铃薯200 g, 蔗糖20 g, 琼脂20 g, 水1 000 mL。

1.2 试验方法 1.2.1 粗甾体皂苷的提取及分离

将粉碎干燥的黑刺菝葜根装入渗漉筒中, 加入体积分数为70 %的工业酒精室温浸泡, 48 h后放出全部液体, 减压浓缩, 向渗漉筒中再加入新酒精, 循环5次, 减压浓缩得到乙醇提取浸膏, 将乙醇提取浸膏悬浮于水, 然后依次用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取, 正丁醇萃取液减压浓缩得到总甾体皂苷(R)。总甾体皂苷(R)用大孔树脂D101进行反向柱层析, 水洗除糖后, 用不同浓度的乙醇依次洗脱, 将各洗脱液合并, 减压浓缩, 得到不同极性的甾体皂苷混合物R-5、R-6、R-7、R-8、R-9和R-10。

1.2.2 单体甾体皂苷的分离

样品R-6和R-8进行反复硅胶柱层析, 用不同比例氯仿-甲醇-水洗脱, 得白色粉末粗品, ODS柱色谱用(甲醇:水)洗脱, sephedaxLH-20柱纯化, 从R-6部分得到化合物Ⅰ, Ⅱ和Ⅲ; 从R-8部分得到化合物Ⅳ。

1.2.3 抑菌活性初步测定(方中达, 1998; 李仪奎, 1991)

采用滤纸片扩散法测定样品R, R-5、R-6、R-7、R-8、R-9、R-10和化合物Ⅰ—Ⅳ的抑菌活性。采用以涂布法无菌操作接种, 每种菌接5个培养皿, 每皿接种量0.2 mL, 用刮铲抹匀, 取适量浸膏水浴加热(温度不超过45 ℃)溶解, 然后取灭菌滤纸圆片分别浸入各样品数分钟取出, 稍干后放入接有菌种的培养皿, 每皿3片, 各纸片间距离相等, 呈等边三角形放置, 每个处理做4个重复。同时以滤纸片浸入无菌水作对照, 放置于28 ℃下(细菌培养24 h, 真菌培养72 h), 用十字交叉法测量抑菌圈直径, 取其平均值作为试验结果。以蒸馏水作对照。最低抑菌浓度(MIC)采用二倍稀释法测定, 即将各样品配成每mL含10 mg固形物的药液, 再按倍比稀释法依次将药液稀释成10~0.002 mg·mL-1的稀释液。取组织培养板(96孔), 每孔加入190μL及10μL菌悬液, 同时做稀释及无菌水对照。培养板培养条件同上, 无菌生长的那一孔药液即为最低抑菌浓度。

1.2.4 化合物结构鉴定

利用UV、IR、NMR和MS等波谱方法和参考文献对照法, 对化合物Ⅰ—Ⅳ进行结构鉴定。

2 结果与分析 2.1 甾体皂苷抑菌效果

由表 1可见:总皂苷R除对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌有较弱抑制活性外, 对其他菌种几乎无抑制活性; 除样品R-5和R-6对少数细菌有抑制活性外, 其他样品R-7、R-8、R-9、R-10均对细菌有较强的抑制活性, 但是从中分离的甾体皂苷相对细菌的抑制性较弱或者没有; 样品R-5和R-6除绿色木霉除外对所有供试真菌无抑制性, 样品R-7和R-8对康氏木霉无抑制活性, 样品R-8、R-9和R-10均对青霉和黄曲霉无抑制活性, 样品R-9和R-10对黑色木霉也无抑制活性, 但是从其中分离的单体甾体皂苷几乎对所有真菌表现出很强的抑制活性。从最低抑菌浓度(MIC)看:除总皂苷R外其他所有样品对绿色木霉、样品R-8和R-9对蜡状芽孢杆菌和普通变形杆菌、样品R-7和R-8及R-9对枯草芽孢杆菌、样品R-8和R-9对巨大芽孢杆菌及金黄色葡萄球菌、样品R-9和R-10对大肠杆菌、样品R-7和R-8对黑色木霉、样品R-7对青霉和黄曲霉都有非常强的抑制活性; 化合物Ⅰ对青霉及黄曲霉和康氏木霉、化合物Ⅱ对青霉和康氏木霉、化合物Ⅲ对黑曲霉及黄曲霉和康氏木霉、化合物Ⅳ对青霉及黄曲霉和康氏木霉有非常强抑制活性(表 1)。对照均不显示抑菌活性。

2.2 抗菌单体化合物的结构鉴定

化合物Ⅰ:白色针状结晶(50 mg), m.p. 265~267 ℃; Lieberman-Burchand反应呈蓝绿色; Molish反应反应液界面出现紫色环。FAB-MS m/z:747[M+Na]⁺, 731[M+Li]⁺; IR (KBr)cm^-1:3 439.2(OH), 2 947.14 (CH), 1 705.88(C=0), 1 455.89, 1 383.06, 1 245.14, 1 057.91, 945.10, 917.00, 899.30, 855.00(25-R螺甾烷醇甙, 强度899.30 cm^-1>917.00 cm^-1); ¹HNMR(溶剂DMSO-d₆, 内标物TMS, 以下同): δ4.979 (1H, d, J=6.8 Hz, H-1″)、4.544 (1H, q, J=7.0 Hz, H-16), 3.590 (1H, dd, J=10.5, 3.7 Hz, H-26a), 3.491 (1H, dd, J=10.5、10.5 Hz), 2.312(1H, dd, J=12.4, 4.2 Hz, H-7eq), 2.080 (1H, dd, J=12.0, 2.9 Hz, H-5), 1.964 (1H, dd, J=12.4 Hz, H-7ax), 0.902 (3H, d, J=6.9 Hz, H-21), 0.728 (3H, s, H-18), 0.719 (3H, d, J=5.7 Hz, H-27), 0.657(3H, s, H-19); ¹³C-NMR谱皂苷元中δ:35.8(C-1), 29.7(C-2)、76.3(C-3)、26.0 (C-4)、55.4(C-5)、209.7(C-6)、45.8(C-7)、36.6(C-8)、52.4(C-9)、40.9(C-10)、20.7(C-11)、40.0(C-12)、40.3(C-13)、55.4(C-14)、31.1(C-15)、79.9(C-16)、61.7(C-17)、16.0(C-18)、12.7(C-19)、41.0 (C-20)、14.5(C-21)、108.3(C-22)、30.8(C-23)、28.4(C-24)、30.8(C-25)、66.8(C-26)、17.0(C-27); inner-Glu中δ: 100.4(C-1)、73.3(C-2)、75.3(C-3)、70.4(C-4)、76.5(C-5)、67.1(C-6); 6-ara中δ: 103.3(C-1)、70.1(C-2)、72.4(C-3)、68.1(C-4)、65.8(C-5)。根据以上光谱数据的解析数据及与文献(Ju, 1993; 张存莉, 2003)对照, 鉴定化合物Ⅰ为25-R-螺甾烷-3β-醇-6-酮-3-O-[α-L-吡喃阿拉伯糖基(1→6)]-β-D-吡喃葡萄糖苷, 即拉克索皂苷-3-O-[α-L-阿拉伯吡喃糖基-(1→6)]-β-D-葡萄吡喃糖苷, 其结构式见图 1。

化合物Ⅱ:白色粉末(100 mg), m. p 268~271 ℃, Licberman-Burchand反应呈蓝绿色; Molish反应反应液界面出现紫色环。FAB-MS m/z:909[M+Na]⁺, 893 [M+Li]⁺, 545 [M-162-162-H₂O+H]⁺。IR (KBr) cm^-1 : 3 422.08(OH), 2 945.28(CH), 1 705.17(C=0), 1 453.45, 1 378.70, 1 249.97, 1 052.30, 980, 930, 900.22, 866.96 (25R-螺甾烷醇甙, 强度900.20>930.00); ¹HNMR:δ4.415 (1H, d, J=8.0 Hz, H-1″′), δ4.327 (1-H, J=8.0 Hz, H-1″), 4.105 (1H, d, J=6.8 Hz, H-1′), 4.544 (1H, q, J=7.0 Hz, H-16), 3.590 (1H, dd, J=10.5、3.7 Hz, H-26a), 3.491 (1H, dd, J=10.5、10.5 Hz, H-26b), 2.319 (1H, dd, J=12.4、4.2 Hz, H-7eq), 2.080 (1H, dd, J=12.0、2.9 Hz, H-5), 1.964 (1H, dd, J=12.8、12.4 Hz, H-7ax)0.902 (3H, d, J=6.9 Hz, H-21), 0.727(3H, s, H-18), 0.718(3H, d, J=5.7 Hz, H-27), 0.658 (3H, s, H-19)。¹³C-NMR谱皂苷元中δ: 35.8(C-1), 29.7(C-2)、76.3(C-3)、26.0(C-4)、55.4(C-5)、209.7(C-6)、45.8(C-7)、36.6(C-8)、52.4(C-9)、40.9(C-10)、20.7(C-11)、40.0(C-12)、40.3(C-13)、55.4(C-14)、31.1(C-15)、79.9(C-16)、61.7(C-17)、16.0(C-18)、12.7(C-19)、41.0(C-20)、14.5(C-21)、108.3(C-22)、30.8(C-23)、28.4(C-24)、30.8 (C-25)、65.8(C-26)、17.0(C-27); inner-Glu中δ: 100.1(C-1)、74.8(C-2)、75.6(C-3)、79.9(C-4)、73.0 (C-5)、67.7(C-6); 4-Glu中δ: 103.0(C-1)、73.2(C-2)、76.3(C-3)、70.5(C-4)、75.5(C-5)、60.9(C-6)、6-ara中δ: 103.7(C-1)、72.7(C-2)、73.2.(C-3)、70.0(C-4)、66.8(C-5)。根据以上光谱数据的解析及与文献(Ju et al., 1993; Jia et al., 1992)对照, 鉴定化合物Ⅱ为:拉克索皂甙-3-O-[β-D-葡萄吡喃糖基-(1→4)]-[α-L-阿拉伯吡喃糖基-(1→6)]-β-D-葡萄吡喃糖苷, 其结构式见图 2。

化合物Ⅲ:白色粉末, 白色粉末(26 mg); FAB-MS m/z:925 [M+Na]⁺, 903[M+H]⁺。IR (KBr)cm^-1:3 424(OH), 2 940(CH), 1 710(C=O)、1 450, 1 372, 1 253, 1 253, 1 169, 1 158, 1 064, 1 040, 955, 905, 860, 775;¹HNMR : 5.49(1H, d, J=7.9 Hz, Glu H-1), δ5.09(1H, d, J=7.4 Hz, AraH-1)、4.90 (1H, d, J=7.8 Hz, inner-Glu-H), 4.55(1H, q-like, J=6.9 Hz, H-16), 2.36(1H, dd, J=12.8、4.0 Hz, H-7eq), 2.16(1H, dd, J=12.5、2.2 Hz, H-5), 2.00(1H, dd, J=12.8、12.8 Hz, H-7ex), 1.15 (3H, d, J=6.9 Hz, H-21), 0.79(3H, s, H-18), 0.64 (3H, s, H-19)。¹³C-NMR谱皂苷元中δ: 36.5(C-1), 29.3(C-2)、77.3(C-3)、27.0(C-4)、56.3(C-5)、209.6(C-6)、46.6(C-7)、37.2(C-8)、53.4(C-9)、40.9(C-10)、21.5(C-11)、39.6(C-12)、41.3(C-13)、56.4(C-14)、31.7(C-15)、79.9(C-16)、62.7(C-17)、16.3(C-18)、12.9(C-19)、41.8(C-20)、14.9(C-21)、108.8(C-22)、30.8(C-23)、24.0(C-24)、39.2(C-25)、64.0 (C-26)、64.4(C-27); inner-Glu中δ: 100.3(C-1)、74.8(C-2)、75.6(C-3)、79.9(C-4)、73.0(C-5)、67.7 (C-6); 4-Glu中δ: 103.0(C-1)、73.2(C-2)、76.3(C-3)、、70.5(C-4)、75.5(C-5)、60.9(C-6)、6-ara中δ: 103.7(C-1)、72.7(C-2)、73.2.(C-3)、70.0(C-4)、66.8(C-5)。根据以上光谱数据的解析及与文献(Ju et al., 1994)对照, 鉴定化合物Ⅲ为:3β, 27-二羟基-(25s)-5α-螺甾烷-6-酮3-O-[β-D-葡萄吡喃糖基-(1→4)-O-[α-L-阿拉伯吡喃糖基-(1→6)]-β-D-葡萄吡喃糖苷, 其结构式见图 3。

化合物Ⅳ:白色粉末(26 mg), m.p.260~262 ℃; FAB-MS m/z:925[M+Na]⁺, 909[M+Li]⁺。IR (KBr) cm^-1 : 3 424(OH), 1 642(C=CH), 1 048(C-O-C), 988, 840, 821(Δ⁵); ¹HNMR:5.54(1H, d, J=7.8 Hz, Glu H-1), δ 5.09(1H, d, J=7.4 Hz, AraH-1)、4.80 (1H, d, J=7.8 Hz, inner-Glu-H), 1.15 (3H, d, J=6.9 Hz, H-21), 0.80 (3H, s, H-18), 0.76(3H, s, H-19), 0.71 (3H, d, J=5.9 Hz, H-27)。¹³C-NMR谱皂苷元中δ: 37.9 (C-1), 31.8(C-2)、77.3(C-3)、38.8(C-4)、140.3(C-5)、121.0(C-6)、33.9(C-7)、34.5(C-8)、49.4(C-9)、36.2(C-10)、20.2(C-11)、30.6(C-12)、44.2(C-13)、53.4(C-14)、31.1(C-15)、88.7(C-16)、88.9 (C-17)、16.7(C-18)、19.0(C-19)、44.2(C-20)、9.2(C-21)、108.9(C-22)、31.4(C-23)、22.5(C-24)、37.7(C-25)、62.9(C-26)、65.4(C-27); inner-Glu中δ: 100.7(C-1)、74.8(C-2)、75.3(C-3)、79.8(C-4)、73.0(C-5)、67.7(C-6); 4-Glu中δ: 103.0(C-1)、73.7(C-2)、76.3(C-3)、70.5(C-4)、74.8(C-5)、60.9(C-6)、6-ara中δ: 103.6(C-1)、72.7(C-2)、73.3 (C-3)、70.0(C-4)、66.7(C-5)。根据以上光谱数据的解析及与文献(Ju et al., 1994; 张存莉等, 2003a; 2003b)对照, 鉴定化合物Ⅳ为: (25D)螺甾-5-烯-3β, 17α, 27-三羟基-3-O-[β-D-吡喃葡萄糖-(1→4)]-[α-L-吡喃阿拉伯糖(1→6)]-β-D-吡喃葡萄糖甙, 其结构式见图 4。

3 结论与讨论

黑刺菝葜根中筛选到对细菌和真菌有强抑制活性的甾体皂苷:样品R-8和R-9对蜡状芽孢杆菌和普通变形杆菌, 样品R-7、R-8和R-9对枯草芽孢杆菌, 样品R-8和R-9对巨大芽孢杆菌, 样品R-9和R-10对大肠杆菌, 样品R-8和R-9对金黄色葡萄球菌, 样品R-7对黑曲霉, 各样品(R除外)对绿色木霉, 化合物Ⅰ、Ⅱ和Ⅳ及样品R-7对青霉, 化合物Ⅰ、Ⅲ和Ⅳ及样品R-7对黄曲霉, 化合物Ⅰ-Ⅳ对康氏木霉等都有较低的MIC值和非常强的抑制活性; 这些菌种大部分都是有害菌种, 对人体、动物和农作物带来灾害, 因此黑刺菝葜在抗菌活性成分方面有很大的开发利用价值。

从抑菌实验可知, 有必要扩大黑刺菝葜对各种革兰氏致病细菌、其它真菌的抑菌活性研究; 各种分离物普遍对绿色木霉抗性很强, 可能黑刺菝葜根中存在着专属抑制绿色木霉的有效成分, 需要深入研究抗绿色木霉和活性成分之间的构效关系, 为开发抗真菌的药物提供理论基础; 各分离物对供试菌的抑菌活性不同, 其抑菌机理需要进一步研究, 另外本实验对真菌的抑菌作用只是观察其对菌丝的抑菌效果, 这些菌丝是仅受到抑制还是被完全杀死, 需要进一步的研究。

植物体内常常存在着多种具有相同或相似生物活性的物质, 这些物质常具有相似的分子结构, 可以单独或集体表现出一种或多种生物活性, 一般称这些协同作用的成分为“活性分子群”。从样品R-6和其中分离的单体甾体皂苷Ⅰ-Ⅲ及样品R-8和其中分离的单体化合物Ⅳ可以看出, 黑刺菝葜植物体内不仅存在着抑菌“活性分子群”而且存在着增菌的“活性分子群”, 因此在分离抗菌活性成分时, 常常需要运用现代的植物化学分离技术, 除去增菌的“活性分子群”, 才能筛选出抑菌“活性分子群”。