磷是植物生长发育不可缺少的营养元素之一。它既是构成植物体内重要有机化合物的组成成分, 同时又以多种方式参与植物体内的生理过程, 对植物的生长发育、生理代谢、产量和品质都起着重要作用(Epsein, 1972)。在我国, 土壤中可溶性磷酸盐含量为1.0μmol·L^-1, 甚至更小, 远不能满足植物正常生长的要求, 因此我国大部分地区土壤普遍缺磷, 南方土壤尤为严重。磷作为限制植物生长的障碍因子也已经越来越受到人们的重视(张福锁, 1993; 徐向华, 2002; 周志春等, 2003)。不同类型植物利用土壤磷素的能力不同(Batten, 1992), 如何根据植物自身潜力充分利用土壤磷成为近年来科学家所关注的焦点。

马尾松(Pinus massoniana)是我国特有的乡土树种, 分布广、适应性强(周政贤, 2001), 具有速生、丰产、综合利用程度高、纤维优良等优良特性, 是我国主要工业用材树种之一, 已成为南方最主要的造林先锋树种(丁贵杰等, 2002)。虽然南方山地土壤有效磷缺乏是一种普遍现象, 但马尾松并未表现出缺磷症状而依然生长良好, 这说明马尾松有适应低磷胁迫的应对机制。以往对草本植物的磷胁迫研究较多, 而对树木研究较少。本文着重从生理生化的角度探讨马尾松对低磷胁迫的响应, 以阐明其耐低磷胁迫的机制。

1 材料与方法 1.1 材料的选取及处理

选取0.2~1.0 mm纯石英砂, 砂子先用3%稀盐酸浸渍1周, 再用水冲洗至水无明显的氯离子反应为止, 然后用营养液浸洗, 每天2次, 直到营养液同砂粒接触24 h内pH基本无变化为止。将石英砂装入聚乙烯塑料盆中(盆上口径22 cm, 下口径12 cm, 高17 cm), 每盆3 kg, 压实。试验选用均匀一致高15 cm左右的马尾松当地种源幼苗, 移栽1星期后开始处理, 处理120 d后收获。

采用澳大利亚专家专门为单因素试验研制的配方(仲崇禄, 1996), 共设计5个不同磷浓度处理, 分别为无磷(P0)、极低磷(P1)、低磷(P2)、中等磷(P3)和1个对照(CK), 对应的磷浓度分别为0、0.01、0.1、0.2、1.0 mmol·L^-1, 各处理的其他元素控制在同一正常供应水平; 每个水平设3个重复, 每3 d浇1次营养液, 中间酌情补充水分。每15 d用水洗1次石英砂。收获前测定各生理生化指标。

1.2 测定方法 1.2.1 光合色素分析

光合色素含量采用乙醇-丙酮提取, 分光光度计测定。取不同处理的马尾松针叶0.1 g左右, 将其剪成2~3 mm长的小段, 放入具塞试管中并加入10 mL乙醇-丙酮混合液(体积比为1:1), 室温(25 ℃)下置于黑暗处浸提至材料完全变白为止(期间摇动数次)。测定采用张宪政(1986)的方法。

1.2.2 光合作用测定

净光合速率、蒸腾速率和暗呼吸速率均采用CI-301 CO₂分析仪测定。以单位时间(s)单位面积(m²)所消耗的CO₂量(μmol)表示净光合速率、蒸腾速率, 即μmol CO₂·m^-2s^-1; 以单位时间(s)单位面积(m²)所消耗的O₂量(μmol)表示暗呼吸速率, 即μmol O₂·m^-2s^-1; 每个处理重复测定4次。马尾松针叶叶面积的测定参照朱守谦(1989)的公式。

1.2.3 生化指标测定

可溶性糖含量测定采用蒽酮比色法(张志良, 1990); 蛋白质含量测定采用考马斯亮蓝法(张志良, 1990); 过氧化物酶(POD)活性测定采用愈创木酚比色法(张志良, 1990); 超氧化物歧化酶(SOD)、脯氨酸测定参考邹琦(1995)的方法; 丙二醛(MDA)测定参考中国科学院上海植物生理研究所(1999)的方法。

1.2.4 生物量测定

采用烘干称重法, 重复3次。

2 结果与分析 2.1 根冠比对低磷胁迫的响应

低磷逆境中植物最先感受养分胁迫的器官是根系, 根冠比是影响植物养分吸收效率的重要因子。从图 1可以看出, 马尾松的根冠比对不同磷浓度处理的响应差异显著, 随处理磷浓度的降低马尾松根冠比增加, 无磷处理条件下(P0)马尾松根冠比最大。缺磷对马尾松地上部分的抑制作用大于对根的影响。

2.2 马尾松植株生理过程对低磷胁迫的响应 2.2.1 净光合速率、蒸腾速率和暗呼吸速率

磷参与植物生长发育全过程中各种代谢活动, 对植物光合作用的影响较大。从图 2可以看出, 低磷胁迫使马尾松的净光合速率降低, 并且随供磷水平的降低, 马尾松的净光合速率呈下降趋势, 对照处理(CK)的净光合速率最高, 达3.03μmol CO₂·m^-2s^-1, 无磷处理(P0)净光合速率最低, 为0.64μmol CO₂·m^-2s^-1, 仅是对照处理的1/5。

不同磷浓度处理马尾松蒸腾速率的变化趋势与净光合速率的变化趋势一致(图 2), 表现为一定范围内随供磷水平的降低, 蒸腾速率随之减小, 蒸腾速率最低值出现在缺磷水平上, 为0.17μmol CO₂·m^-2s^-1。

磷参与呼吸过程中氧化还原酶类的组成, 或作为呼吸系统中酶的活化剂, 因此磷对呼吸作用有着重要的影响。随供磷水平的降低, 暗呼吸速率呈现逐渐升高趋势(图 2), 无磷处理(P0)的暗呼吸速率最大, 达1.21 μmol O₂·m^-2s^-1。

2.2.2 光合色素

叶绿素是捕获光能、同化CO₂的基本色素。在一定范围内, 叶绿素含量越高, 光合作用越强。从表 1可知, 低磷抑制马尾松叶绿素的形成。随供磷水平的降低, 叶绿素a、叶绿素b和总叶绿素含量均降低, 而类胡萝卜素含量则无明显变化。经t检验, 不同浓度磷处理的叶绿素a含量差异显著, 主要表现为P3、CK与P0、P1、P2处理之间差异显著, 而P3和CK之间, 以及P0、P1、P2之间差异不显著。因此, 单从叶绿素a指标来看, 马尾松在低磷时生长会受到抑制, 而在中等磷浓度时生长几乎不受影响。

2.3 马尾松叶片对磷胁迫的生化响应 2.3.1 MDA、POD和SOD

MDA作为植物细胞膜脂过氧化作用的产物之一, 其含量的高低能够一定程度上反映膜脂过氧化作用水平和膜结构的受害程度及其植株的自我修复能力。不同磷处理的MDA含量差异显著(图 3a), 主要表现为无磷处理(P0)与其他处理间的差异显著, P0处理的MDA含量比CK增加49.3%。MDA含量升高, 表明膜脂过氧化程度增强, 说明缺磷导致氧化胁迫, 而低磷和中等磷处理, 马尾松针叶膜脂过氧化与对照相比无明显变化。

植物在逆境条件下保护酶系统的变化已广泛应用于植物对逆境的反应机理的研究。从图 3b中可以看出, 低磷处理的叶片POD和SOD活性都增加。与对照处理(CK)相比, 随供磷水平的降低, POD活性提高, 无磷处理(P0)的POD活性最高, 为对照(CK)的1.8倍, 其次是极低磷(P1)、低磷(P2)和中等磷(P3)处理, 分别为对照的1.7、1.6和1.2倍。与对照相比, 中等供磷(P3)、低磷(P2)、极低磷(P1)和无磷(P0)处理的SOD活性分别为对照的1.09、1.35、1.48和1.69倍。

2.3.2 蛋白质、脯氨酸和可溶性糖

逆境胁迫可引起植物基因表达的变化, 使某些正常蛋白质合成受阻, 逆境蛋白被诱导合成, 使植物在代谢和结构上发生调整, 增强抵御不良环境的能力。从图 4a可以看出, 对照供磷(CK)与中等供磷的可溶性蛋白含量分别为6.72 mg·g^-1和6.51 mg·g^-1, 二者间差异不显著。但随磷浓度的进一步降低, 可溶性蛋白含量也显著降低, 低磷(P2)、极低磷(P1)和无磷处理(P0)的可溶性蛋白比对照分别下降了29.17%、31.85%和67.71%, 与对照之间均差异显著。

脯氨酸在植物体内的积累, 是不良逆境胁迫诱导的一种生理生化反应, 脯氨酸与植物抗性的关系越来越受到人们的重视。从图 4b可知, 低磷胁迫下, 马尾松叶中游离脯氨酸的积累增加。除中等磷(P3)与对照处理间, 以及P0和P1处理间脯氨酸含量差异不显著外, 其他各个处理间均差异显著。随供磷水平的降低, P0和P1处理的脯氨酸含量增加较大, 分别为242.50μg·g^-1 FW和268.87μg·g^-1 FW。

缺磷条件下马尾松的可溶性糖含量显著高于对照(图 4c)。经t检验, 无磷(P0)、极低磷(P1)、低磷(P2)处理与对照(CK)处理差异显著, 而中等磷(P3)处理与对照(CK)间差异不显著, 这可能是由于植株缺磷体内碳水化合物代谢受阻, 导致体内糖类积累所造成的。

3 结论与讨论

低磷逆境中植物最先感受养分胁迫的器官是根系。许多研究表明:磷胁迫下, 光合产物向根运转增加, 提高根冠比。低磷胁迫下, 马尾松根冠比提高, 且随磷浓度降低, 其根冠比增加。这实际上是光合产物在分配方向上的强度随着磷素水平的改变而改变。在低磷条件下, 光合产物分配到根部的比例较高, 以促使根系发达, 扩大与外界环境的接触面, 从而有可能使其获得的磷素增加。低磷使马尾松根冠比增大, 表明低磷使同化物转运到根系的比例增大, 地上部同化物含量相对减小, 因而低磷对马尾松地上部生长抑制相对大于对根系的影响。低磷生境下, 植物根冠比提高是其对逆境胁迫的一种主动适应性反应机制, 这已为许多研究者的研究所证实(沈宏等, 2001; 梁秀兰等, 2005)。

光合作用是植物进行物质积累的主要过程, 是造成植物生物量积累差异的主要内在原因之一。缺磷对光合作用的影响是多方面的, 一般表现为负面效应(周开勇等, 1993; 潘晓华等, 1997)。本试验研究结果表明, 低磷胁迫下, 马尾松针叶净光合速率、蒸腾速率下降, 叶绿素、可溶性蛋白、可溶性糖含量降低, 而暗呼吸速率、游离脯氨酸含量增加, 这与前人对甘蔗(Saccharun officinarum)、玉米(Zea mays)的研究结果一致(万美亮等, 1999; 梁秀兰等, 2005)。叶绿素是植物进行光合作用原初反应的光能“捕获器”, 同时又在光能传递与转换中起着重要作用, 因此低磷胁迫下, 叶绿素含量降低直接导致净光合速率下降; 另外, 在磷胁迫下, 叶片中可溶性蛋白下降可能导致Rubisco含量减少, 从而也会引起光合速率的降低。低磷胁迫条件下马尾松为维持自身生存而提供必要的能量代谢, 表现为暗呼吸速率升高, 而暗呼吸速率升高则不利于植物光合产物的积累。低磷条件下, 马尾松针叶净光合速率降低以及暗呼吸速率增加是导致其生物量受到抑制的主要原因。

植物在逆境条件下的膜脂过氧化反应和保护酶系统SOD、POD、CAT等活性的变化已广泛应用于植物对逆境的反应机理的研究(Bowler et al., 1992; 万美亮等, 1999; 刘厚诚等, 2003; 潘晓华等, 2003)。MDA是植物细胞膜脂过氧化的产物之一, 其含量的高低在一定程度上能反映脂膜的过氧化水平和膜结构的受害程度及植株的自我修复能力。本试验中, 缺磷导致马尾松针叶MDA含量增加, 低磷胁迫条件下, 马尾松针叶POD和SOD活性提高。这主要是由于缺磷培养后植株的活性氧自由基积累刺激了保护酶系统活性的提高, 同时, 保护酶活性的提高又可清除活性氧自由基, 即低磷胁迫, 一方面刺激马尾松叶片产生更多的自由基, 加快膜脂过氧化, 导致MDA含量增加; 另一方面刺激了保护酶系统(SOD, POD)活性的增强, 加快自由基的清除, 减轻膜脂过氧化, 降低其体内MDA的含量。这两方面形成一个动态平衡, 是马尾松耐低磷胁迫的主要生理反应机制之一。