水曲柳(Fraxinus mandshurica)是东北3大珍贵硬阔叶用材树种之一，雌雄异株。由于不同性别的植株在形态学、生物学特性以及经济价值等方面存在一定的差异，林业生产中常常希望根据经营目的与利用方向选择特定性别的植株，尤其在种子园营建及杂交育种中，必须明确区分雌雄株。而目前水曲柳的性别鉴定工作主要在开花期间进行，性成熟前无法鉴别植株性别，即使性成熟后，非花期也很难区分雌雄株。因此有必要应用现代生物学方法建立一套准确、简便的水曲柳成年树性别鉴定技术，为苗木性别早期鉴定奠定基础。

目前国内外已有一些关于雌雄异株树木的性别鉴定的报道，代谢次生产物(如酚类物质等)、氧化酶活性都可用于性别鉴定。李国梁等(1993；1995)发现杨梅(Myrica rubra)、猕猴桃(Actinidia chinensis)、香榧(Torreya grandis)、银杏(Ginkgo biloba)等不同性别植株的成熟叶片中水溶性酚类物质的含量差异达到显著性水平。赵林森等(1998；1999)对复叶槭(Acer negundo)雌雄株的酸性醇溶性研究发现酚类物质含量、成分在雌雄株间存在明显差异，可作为区分雌雄株的依据。另外，赵云云等(1996)、茹广欣等(1998)分别报道构树(Broussonetia papyrifela)，毛白杨(Populus tomentosa)雌株的酶活性均高于雄株，但迄今尚未见对水曲柳性别鉴定的研究报道。本试验利用酒石酸铁比色法对水曲柳雌雄植株水溶性酚类物质含量进行测定，利用高效液相色谱(HPLC)法对醇溶性酚类物质组成及总量进行分析，利用分光光度计法对超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化物酶(POD)、多酚氧化酶(PPO)3种氧化酶进行活性分析，以揭示雌雄株间酚类化合物和几种氧化酶活性的差异及随季节的变化规律，探索水曲柳雌雄鉴别的指标，为实生苗的早期性别鉴定提供参考。

1 材料和方法 1.1 试验材料

水曲柳成年雌、雄株叶片取自东北林业大学实验林场37年生人工林。标记光照条件一致的树、雄树各30株，记号为：♀₁，♀₂，…，♀₃₀和♂₁，♂₂，…，♂₃₀。在5—10月一个完整的生长周期内对样株树冠的同一高度、同一方位阶段性连续采样，选取成熟功能叶，及时洗净、拭干。

1.2 试验方法

1) 比色法测定水溶性酚类物质将叶片放于干燥箱内110 ℃杀青40 min，80 ℃烘干约6 h至恒重，研磨备用。采用酒石酸铁比色法测定水溶性酚类物质总量, 按经验公式计算其含量，C_多酚=(A×7.826×V₁)/(10×V₂×m)式中：C_多酚为样品中水溶性酚含量(mg·g^-1DW)；A为样品光密度值；V₁为供试液总量；V₂为试液量；m为样品质量(阮宇成等，1983)。

2) HPLC法测定醇溶性酚类物质称取研磨样品0.4 g，加入甲醇2 mL，超声波提取5 min，60 ℃水浴2 h，12 000 r· min^-1离心20 min，再0.45 μm滤膜过滤，即为进样液。液相色谱仪为waters 600-717-2996型，色谱柱为HiQsil C18V型(4.6 mmφ × 250 mm)，检测波长为270 nm，流动相为甲醇-高氯酸水溶液(pH=2.5)，梯度洗脱：0~35 min，甲醇浓度2%~32%；35~65 min，甲醇浓度32%~98%，流速1 mL·min^-1，进样量10 μL，外标法定量。按下列公式计算样品中各组分含量，C_x=(A_x×C_b)/(A_b×样品质量)，式中：C_x为样品中某种组分的含量(μg·g^-1DW)；A_x为样品中该组分的吸收峰面积；C_b为该组分标样的含量；A_b为该标样的吸收峰面积。

3) 氧化酶活性测定取1 g左右鲜样于液氮中研磨至粉末状，称取0.5 g加入2.5 mL磷酸缓冲液，超声波处理1 min，冰浴5 min，16 000 r· min^-1离心5 min，取上清4? ℃储存待测。SOD、POD和PPO活性测定方法分别参考罗广华等(1983)、朱广廉等(1990)和刘金龙等(2002)方法。3种氧化酶活性值均为相对活性值。

2 结果与分析 2.1 水溶性酚类物质含量在生长季节内的变化趋势及方差分析

水曲柳雌雄株叶片水溶性酚类物质含量月份间的变化趋势大致相同(图 1)，5—6月水溶性酚含量显著增加，6月达到整个测定结果的最大值，而6—7月水溶性酚含量骤然下降，7月几乎又达到整个测定结果的最小值，至此水溶性酚含量开始缓慢上升然后下降。方差分析雌、雄株叶片水溶性酚类物质含量月份间差异极显著(F_♀=26.130 5**, F_♂=48.652 1* *)。5、6和7月雌雄株叶片水溶性酚含量差异显著，雄株水溶性酚含量分别高于雌株34.8 9%、21.19%和27.49%(表 1)。因此如果将水溶性酚类物质含量作为水曲柳性别鉴定指标时，应该选在8月份前进行。

5月份雄株水溶性酚含量变化范围为10.856 0~22.779 5 mg·g^-1DW，雌株为6.582 4~18.353 1 mg·g^-1DW；6月份雄株水溶性酚含量变化范围为16.768 7~26.440 6 mg·g^-1DW，雌株为12.674 1~22.979 9 mg·g^-1DW；7月份雄株水溶性酚含量变化范围为7.593 0~12.785 0 mg·g^-1DW，雌株为3.686 0~11.874 7 mg·g^-1DW。由于雌雄间水溶性酚含量范围部分重叠，因此此结果仅作一般参考。

2.2 水曲柳雌雄植株叶片中醇溶性酚类物质组分与含量比较

以12种酚类物质作为标样，其液相色谱图见图 2。HPLC法分析雌雄株醇溶性酚类物质，统计样品中各组分平均含量(表 2)，结果表明雄株苯甲酸、阿魏酸的含量明显高于雌株样品，平均高于雌株44.05%和39.77%；而雌株样品中丁香酸和杨梅黄酮的含量均明显高于雄株，平均高于雄株41.64%和18.98%。追踪分析30对雌雄株醇溶酚HPLC图发现，雌株样品在出峰时间为47.0 min左右的未知峰组分的含量远大于雄株样品。8月份雌雄株间原儿茶酸数量差异最为显著，即雄株样品中93.33%不含原儿茶酸，其他月份雌雄间组分含量无明显数量性差异。图 3为8月份单株HPLC分析图。因此，原儿茶酸的有无，醇溶性酸成分的差异可作为水曲柳雌雄株鉴别的参考依据。

2.3 水曲柳叶片中醇溶性酚类物质含量在生长季节内的变化趋势及方差分析

雌雄植株叶片醇溶酚含量具有相同的月份间变化趋势(图 4)，在5月份生长初期，雌雄植株都具有最大含量，5—6月含量急剧下降，6—10月含量变化趋势不明显。从醇溶酚总量上看，除8月份结果水曲柳雌、雄株叶片醇溶性酚类物质含量平均值几乎相同外，而在其他生长季节内雄株叶片醇溶性酚类物质含量都明显高于雌株叶片含量。方差分析结果表明，6、7月雌雄株醇溶酚含量差异显著(表 3)。

6月份雄株醇溶酚含量高于雌株35.52%，平均含量为1.148 9 mg·g^-1DW，分布范围为0.619 0~1.678 8 mg·g^-1DW, 雌株平均含量为0.847 8 mg·g -1DW，分布范围为0.488 6~1.207 0 mg·g^-1DW；7月份雄株醇溶酚含量高于雌株39.56%，平均含量为0.837 2 mg·g^-1DW，分布范围为0.430 5~1.243 9 mg·g^-1DW, 雌株平均含量为0.599 9 mg·g^-1DW，分布范围为0.411 8~0.788 0 mg·g^-1DW。另外水曲柳雌、雄叶片醇溶性酚类物质含量随生长时间的增加而减少，5—10月间含量方差分析差异显著(F_♀=44.311 4^**, F_♂=36.756 4^**)。

虽然8月份数据分析水曲柳雌雄株叶片12种醇溶性酚类物质总量差异不显著，但对雌雄各30株树跟踪测定结果分析表明雌雄株在8月份原儿茶酸含量具有明显差异，即93.33%雄株不含原儿茶酸，而86.67%的雌株含有原儿茶酸。因此应用液相色谱法鉴别水曲柳性别时应选在8月份测定。

2.4 水曲柳叶片几种氧化酶相对活性在生长季节内的变化趋势

连续测定5—10月水曲柳雌雄株叶片3种氧化酶即SOD、POD和PPO活性，结果表明雌雄株的3种氧化酶相对活性均值在季节性变化趋势上都相同，而且多为雄株相对活性均值高于雌株相对活性均值(图 5)。

雌雄株叶片SOD相对活性均值都是在5—7月缓慢上升，7月达到第1个峰值后急剧下降，9月份降到最小相对活性，而在10月份相对活性又骤然升高到达第2个峰值。5—9月雌雄株叶片POD相对活性均值几乎呈直线增长，在9月雌雄株POD达到最大相对活性值，至此POD相对活性值开始下降。而PPO相对活性变化曲线与SOD相对活性变化曲线几乎完全相反，雌雄株叶片PPO相对活性均值在5—7月急剧下降，7—10月迅速上升，在7月出现PPO相对活性最小值。

2.5 雌雄植株叶片几种氧化酶相对活性方差分析

对水曲柳雌雄株叶片SOD、POD和PPO相对活性进行方差分析，结果表明，3种氧化酶活性朋份间差异均达到极显著水平(SOD：F_♀=49.594 9^**, F_♂=56.299 5^**; POD：F_♀=97.998 3^**, F_♂=55.807 45^**; PPO：F_♀=25.905 7^**, F_♂=42.914 5^**)性别间差异也达到显著或极显著水平，方差分析表如下：

分析结果为：1)5—10月雌雄间叶片SOD活性差异均显著，尤其5、10月份生长初、末期的结果差异更是达到极显著水平。5月份96.97%的雄株SOD相对活性值高于0.323，平均值0.424 1，变化范围是0.356 4~0.491 8，而86.67%的雌株SOD相对活性值低于0.323，平均值为0.232 0，变化范围是0.144 8~0.319 3；10月份93.33%的雄株SOD相对活性值高于0.552，平均值为0.676 5，变动范围是0.573 2~0.779 8，而83.33%的雌株SOD相对活性值低于0.552，平均值为0.443 7，变动范围是0.295 1~0.592 3。因此可以把5、10月份SOD相对活性指标作为水曲柳雌雄鉴别参考。

2) 雌雄株间POD活性差异在5、6月达到极显著水平，而在7、8月也达到显著水平。6月份86. 67%雄株的POD相对活性值高于0.734，平均值为0.967 8，变动范围是0.719 7~1.216 0，而90.00%雌株POD相对活性值低于0.734，平均值为0.553 4，变化范围是0.402 3~0.704 5。因此，6月份POD相对活性值也可以作为水曲柳性别鉴定的参考依据。

3) PPO相对活性雌雄株间仅在6、9及10月达到显著差异水平，雄株PPO相对活性值分别高于雌株PPO相对活性值64.93%、58.26%及27.05%，而其余时间测定的雌雄叶片PPO相对活性值间差异不显著，因此不能作为水曲柳性别鉴定的依据。

3 讨论

同工酶是多肽键组成的单体、纯聚体或杂合体，是基因在各种水平调控下表达产生的直接产物，因此其研究也就是以基因产物认识基因的存在和表达，由表现型反映基因型。基因表达既受发育过程的调控，又受外界环境的影响，无论是内因还是外因诱发基因表达时都涉及信号转导，其中一类信号传递分子就是酚类物质，同时酚类物质还与基因的诱导表达有关，因此应用酚类物质进行性别研究具有基因学基础。

目前已有一些应用酚类物质、几种氧化酶活性进行性别鉴定的报道，如赵林森等(1998；1999)研究发现复叶槭雌雄株性别峰为儿茶酸，雌株水溶性酚类物质和酸性醇溶性酚类物质含量均始终高于雄株，本文利用上述方法也得出准确结论即水曲柳雄株水溶性酚类物质和酸性醇溶性酚类物质含量均始终高于雌株，并初步确定性别峰为原儿茶酸。另外，温伟庆等(2002)对银杏雌雄株过氧化物酶和过氧化氢酶活性研究中得出雄株这两种氧化酶活性均大于雌株，而且在幼树期酶活性高时表现更稳定的结果，本实验结果与之相似，水曲柳雄株超氧化物歧化酶和过氧化物酶活性均高于雌株，而且方差分析差异极显著，同时得出结论水曲柳雌、雄株的超氧化物歧化酶、过氧化物酶和多酚氧化酶活性在月份间变化差异均达到极显著水平。另外对石刁柏(Aspargns officinalis)(范双喜等，1995)、千年桐(Aleurites montana)(夏仁学，1996)等树木的几种氧化酶活性研究中也得出过氧化物酶活性与植株性别有关的结论，艾辛等(2000)对黄瓜(Cucumis sativus)的吲哚乙酸氧化酶、多酚氧化酶以及超氧化物歧化酶等几种氧化酶活性研究中发现这3种几种氧化酶活性都可以作为其雌性早期鉴定的生化标记, 其表现为纯雌株比雌雄株酶活性强。综上所述，应用酚类物质和几种氧化酶活性进行植株性别鉴定是完全可行的。

本文结果表明：雌雄株间在6、7月的水溶酚含量和醇溶酚含量差异达到显著水平，雄株苯甲酸、阿魏酸含量高于雌株，丁香酸、杨梅黄酮含量低于雌株，而在出峰时间为47.0 min左右的未知峰组分的含量也远小于雌株，另外在5、10月的SOD活性和6月的POD活性上差异极显著，这些结论都可初步为水曲柳成年雌雄株鉴别提供依据。

雌雄株鉴别技术的应用潜力更主要的在于苗木性别的早期鉴定，本文的研究为下一步的苗木为对象的性别鉴定与分化机理研究打下良好基础。随着实验技术的改进和发展，预计类似几种氧化酶活性、酚类物质的生理生化指标将在植物性别鉴定领域中有着更为广阔的应用前景。