李实蜂(Hoplocampa fulviconis)属膜翅目，叶蜂科，是李(Prunus saliceina)果的一种重要害虫。近年来，李实蜂为害日趋严重，给生产造成了巨大的经济损失。国内已有一些关于李实蜂的研究报道，但多偏重于生物学习性和防治等方面，本实验通过野外调查发现，大石早生、大石中生、盖李、黑宝石4个品种李受李实蜂为害程度存在显著差异，并测定了李实蜂幼虫的活力，探讨李实蜂体内解毒酶活力与李实蜂寄主植物之间的联系，为选育抗李实蜂品种及李实蜂的综合治理提供科学的理论依据。

1 材料与方法 1.1 李实蜂为害不同品种李果的调查分析

在河北省易县解村林场5年生李树园调查，李各品种定植时采用随机区组设计。分别在每株树上、中、下不同方位取样枝，统计结果数和受害果实数。将调查数据进行方差分析，以确定不同品种的受害情况。

1.2 不同品种李果对李实蜂酶活力的影响 1.2.1 李实蜂虫果的采集

2001年5月于易县解村林场采集李实蜂危害的大石早生、大石中生、盖李、黑宝石4品种的李果，放入冰箱中-20 ℃保存。

1.2.2 测定酶源的制备

从虫果中取出幼虫，10头每组，放入玻璃匀浆器加水4 mL，冰浴匀浆，于4 ℃下10 000 r·min^-1离心30 min。取上清液作为酶源，浓度为2.5头·mL^-1，用于谷胱甘肽-S-芳基转移酶活力测定；稀释浓度至0.2头·mL^-1，用于酶源蛋白质含量测定和羧酸酯酶活力测定。

1.2.3 酶源蛋白质含量测定

蛋白质标准曲线的确定：采用考马斯亮蓝染色法将试剂混匀后，用7200型分光光度计测595 nm处光密度值，重复6次，求蛋白质标准曲线方程。酶源蛋白质含量的测定：反应体系为0.2头·mL^-1酶源0.4 mL，水2.6 mL，0.02% CBB-G250 3.0 mL，总体积6 mL，混匀后，用7200型分光光度计测595 nm处光密度值，重复6次，根据蛋白质标准曲线方程求酶源蛋白质含量。

1.2.4 羧酸酯酶活力测定

反应体系为：0.04 mol·L^-1 pH7.0磷酸缓冲液7 mL，0.03 mol·L^-1醋酸-α-萘酯酶底物液(含0.0001 mol·L^-1水杨酸毒扁豆碱)5 mL，0.2头·mL ^-1酶源0.3 mL，在37 ℃水浴中震荡30 min，加入坚固蓝显色剂1 mL，25 ℃恒温放置30 min，7200型分光光度计测600 nm处光密度值，重复6次。根据α-萘酚标准曲线方程求出酶促生成的α-萘酚量。对酶的比活力进行方差分析。

1.2.5 谷胱甘肽-S-芳基转移酶的活力测定

反应体系为0.06 mol·L^-1 pH7.0磷酸缓冲液(含0.002 mol·L^-1乙二胺四乙酸)5.2 mL, 0.05 mol·L^-1还原型谷胱甘肽底物液0.6 mL, 0.03 mol·L^-1 2，4-二硝基氯苯丙酮底物液0.2 mL, 2.5头·mL^-1酶源0.2 mL, 总体积6 mL, 在2 5 ℃下反应5 min, 分光光度计测340 nm处吸光度, 重复3次, 根据酶源蛋白质含量求出酶的比活力, 对酶的比活力进行方差分析。

1.2.6 电泳酶源制备

从不同品种李虫果中取李实蜂老熟幼虫，每组10头，放入玻璃匀浆器中，加样品提取液(pH 8.0 Tris-HCl缓冲液)1 mL匀浆，再加1 mL提取液冲刷匀浆器，洗入离心管，放入离心机中于4 ℃下10 000 r·min^-1离心15 min，取上清夜，置于冰箱中备用。

1.2.7 同功酶电泳

采用不连续聚丙烯酰胺凝胶电泳。分离胶浓度为12%、浓缩胶浓度为3.75%，电极缓冲液为pH8.3 Tris-甘氨酸缓冲液。每个样品槽点样量为35 μL。电泳开始时为20 mA稳流，进入分离胶后30 mA稳流，电泳5 h左右。

1.2.8 酯酶及过氧化物酶染色

酯酶染色：电泳结束后，凝胶用蒸馏水洗涤数次，浸入底物和显色液混合液[醋酸-1-萘酯0.025 g，醋酸-2-萘酯0.025 g，坚牢蓝RR0.1 g，加丙酮4 mL溶解后，加磷酸缓冲液(pH7.0，0.1 mol·L^-1)定容至100 mL]中约30 min，到黑褐色酯酶带清晰为止。用蒸馏水漂洗几次，固定于7%醋酸液中。第3天进行照相。过氧化物酶染色：电泳结束后，凝胶用蒸馏水洗涤数次，浸入染色液(70 mg抗坏血酸，加入20 mL联苯胺储备液，20 mL 0.6% H₂O₂，H₂O 60 mL)中，待出现酶带，立即倒出染色液。用蒸馏水洗涤干净，即用水保存。第2天照相。

2 结果与分析 2.1 不同品种李树受李实蜂为害情况

将1998、1999年解村林场4个品种调查统计结果反正弦转换，进行统计分析，如表 1。经方差分析，李实蜂对各品种的危害程度存在极显著差异。进一步利用新复极差法对比各处理的平均值，如表 2。由此可知，李实蜂对4个品种的李果为害差异极其显著，且黑宝石受害最重，大石早生受害最轻。

2000年解村林场盖李、黑宝石、大石早生、大生果实被害率平均值分别是81.95%，90.04%，81.15%和76.40%。将其进行反正弦(arcsin X_i^1/2)转换，方差分析结果表明果实受害率差异显著。进一步利用新复极差法对比各处理平均值。结果见表 3。可知，李实蜂对4个品种的李果危害差异显著，其中黑宝石受害最重，大石中生受害最轻。且黑宝石与大石中生达极显著水平，结果与1998、1999年调查结果基本一致。说明不同品种的李树对李实蜂的抗性存在差异。

2.2 取食不同李树品种的李实蜂幼虫羧酸酯酶、谷胱甘肽-S-芳基转移酶活力测定(表 4)

羧酸酯酶比活力的大小顺序为盖李>大石早生>大石中生>黑宝石，取食盖李的李实蜂幼虫羧酸酯酶活性最高，比活力为46.029 3。取食黑宝石的李实蜂羧酸酯酶活性最低，比活力为29.310 0，两者相差1.57倍。方差分析表明，4种李树品种对李实蜂幼虫羧酸酯酶的影响存在显著差异。经多重比较，盖李、大石早生、大石中生与黑宝石之间存在显著差异。

谷胱甘肽-S-芳基转移酶活力的大小顺序为黑宝石>大石中生>大石早生>盖李，方差分析表明，4种李树品种对李实蜂幼虫谷胱甘肽-S-芳基转移酶的影响存在显著差异。

2.3 酶谱分析

根据Rf值，将酯酶同功酶酶谱划分为4组区带。如图 1及表 5，即酯酶Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ，分别相当于Rf 0~0.1、0.11~0.20、0.21~0.30、0.31~1.00(距负极7.1 cm处为溴酚蓝示踪线)。由酶谱图可见，取食大石中生的李实蜂幼虫酯酶酶谱可见7条带，取食其他3种的幼虫可见6条带。第1条带酶活性极高，为李实蜂种的特征酶带。第3、4、7条带均依盖李、大石早生、大石中生、黑宝石的顺序酶活性渐弱，第6条带为大石中生仅有，可能是取食大石中生的李实蜂的特征酯酶带。从总的趋势看，盖李、大石早生的酶活性较强，大石中生、黑宝石的酶活性较弱，且大石中生与其他3个品种存在质的差异，证明李实蜂在不同品种上取食出现了明显的生理分化。根据Rf值将过氧化物酶酶谱划分为4组区带。如图 2及表 5，即过氧化物酶Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ，分别相当于Rf 0~0.10、0.11~0.30、0.31~0.60、0.61~1.00(距负极6.5 cm处为溴酚蓝示踪线)。由酶谱图可见：盖李、大石早生酶带数均为10条，大石中生、黑宝石均为7条。第1、2、3、4、8、9、11为取食4个李品种的李实蜂的共有带，且第1、2条带酶活性极高，为特征谱带。第3、4条带大石中生、黑宝石酶活性较强，第8、9条带盖李、大石早生酶活性较强，第11条带依盖李、大石早生、大石中生、黑宝石的顺序活性渐弱。第5、10条带只有盖李、大石早生可见，第6条带仅盖李可见，第7条带仅大石早生可见。由过氧化物酶酶谱也可反映出取食不同品种李的李实蜂在生理上的分化。

3 结论与讨论

昆虫寄主植物形成了某些取食适应机制，寄主植物体内的一些次生代谢物质，对昆虫的正常生理代谢具有毒害作用。同时，许多种类的植物次生代谢物能够对昆虫的解毒酶系产生诱导作用，使酶活性提高。羧酸酯酶、谷胱甘肽-S-芳基转移酶是昆虫体内重要的解毒酶系，在对外源化合物的解毒代谢中起着重要作用。解毒酶系的改变是昆虫取食适应性的重要形式之一，也是衡量抗虫性的一个标志。

本研究中从酶谱与酶活力2个方面反映羧酸酯酶的变化：酶活性的强弱反映在谱带的清晰度上，而酶谱条带的多少与清晰度又反映酶活力的大小，两者相互一致。盖李、大石早生、大石中生的酶活力较大，反映在盖李、大石早生的谱带清晰、大石中生较其他3品种多1条谱带上。由于盖李的羧酸酯酶比活力最大，则在一定范围内盖李的抗性水平较高，黑宝石的抗性水平较低。因此不同的李品种果实对李实蜂幼虫体内的羧酸酯酶、谷胱甘肽转移酶的影响不同。品种间羧酸酯酶活性顺序恰好与谷胱甘肽-S-芳基转移酶活性顺序相反，盖李由α-NA羧酸酯酶活性最高变为谷胱甘肽-S-芳基转移酶活性最低，黑宝石由α-NA羧酸酯酶活性最低变为谷胱甘肽-S-芳基转移酶活性最高。这种酶活性顺序的改变恰恰反映了诱导李实蜂幼虫α-NA羧酸酯酶、谷胱甘肽-S-芳基转移酶活性改变的植物次生代谢物质的种类及含量的不同。野外调查数据分析显示4品种中黑宝石受害最重，所以抗虫性与酶活性差异间有一定联系。

由于羧酸酯酶、谷胱甘肽转移酶是植物次生物质降解的主要酶系，所以寄主植物的次生物质对2种酶的诱导作用很强。它们可能是某些抗虫品种(以次生性物质为主要抗虫机制的作物品种)失去抗虫作用的原因，也是某些取食不同寄主植物的害虫对杀虫剂的敏感性发生变化的原因之一。这可为李实蜂的综合治理提供依据。如果对诱导李实蜂幼虫这2种酶活性发生改变的植物次生代谢物做进一步研究，可能揭示李树中某些化学成分与2种酶活力变化的联系。