蔗扁蛾(Opogona sacchari), 隶属鳞翅目(Lepidoptera)辉蛾科(Hieroxestidae)扁蛾属(Opogona)(杨集昆等, 1997), 是近年来从境外传人我国的一种重要林业危险性有害生物(程桂芳等, 1997)。该虫寄主广泛, 据资料报道(商晗武等, 2003), 目前已发现寄主植物28科87种8变种, 其中, 国外报道24科6种4变种, 国内14科55种2变种, 主要危害巴西木(Dracaena fragrans)、发财树(Pachira macrocarpa)、风梨(Ananas comosus)、一品红(Euphorbia pulcherrima)、朱顶兰(Amaryllis vittata)、木棉(Bombax malabaricum)、大王椰子(Roystonea regia)等观赏植物, 我省新发现还能危害柳树(Salix sp.)、紫藤(Wisteria sinensis)、龙爪槐(Sophora japonica var. pendula)等本地绿化树种。它已对我国花卉苗木和林业生产造成严重威胁。为控制疫情扩散蔓延, 国家林业局将其列入了林业检疫性有害生物名单。

核糖体DNA序列的测定和比对, 为大量生物的系统发育和亲缘关系的鉴定提供了有价值的数据, 并已经在大量生物中应用。特别是核糖体DNA基因(nuclear ribosomal DNA, nrDNA)的内转录间隔区(Internal Transcribed Spacers, ITS)已成为系统与进化生物学研究中的重要分子标记, 具有种的特异性。这是由于ITS区进化速度远快于别的保守区(conserved region), 在不同种或同种不同群体之间的ITS序列也会发生变异。ITS之所以成为理想的测序区域、成为系统与进化研究中的重要分子标记, 主要基于以下几方面原因：第一, 作为18S-28S rDNA的一个组成部分, ITS在核基因组中是高度重复的, 而且通过不等交换和基因转换, 这些重复单位间已发生了位点内或位点间的协调进化(concerted evolution) (Elder et al., 1995)。rDNA基因在同一物种内部进化是一致的, 因而单一个体内的rDNA拷贝间的序列差异非常有限。相比之下, 物种之间则显示出一定的序列差异水平。不同ITS拷贝间的序列趋于相近或完全一致, 这就为对PCR扩增产物直接测序奠定了理论基础(Hsiao et al., 1995; Ainouche et al., 1997); 第二, ITS1、ITS2分别位于18S—5.8S rDNA、5.8S—28S rDNA之间, 而从细菌、真菌到高等植物的18S、5.8S、28S rDNA的序列又高度保守, 这样就可以用与它们序列互补的通用引物对ITS区进行PCR扩增、测序(Hsiao et al., 1995; Ainouche et al., 1997); 第三, 18S、5.8S、28S rDNA基因序列进化缓慢, 但它们之间的ITS序列的进化则相当迅速。因此, 对它的演化进度评价既有一般生物学意义又有特殊生物含义; 第四, 它足够大, 能够提供充足的系统构建所需要的特征。

从GenBank数据库中的ITS序列不难发现, ITS的研究已越来越受到重视, 在昆虫纲中, 已注册的ITS序列已有4 501条(截止2005年4月28日), 其中为鳞翅目的仅为138条, 占3.06%, 没有鳞翅目辉蛾科Hieroxestidae的信息。本文针对来自于5种不同寄主的蔗扁蛾进行ITS序列分析, 以研究其分子进化规律。

1 材料与方法 1.1 材料

试验所用的蔗扁蛾幼虫分别采集于舟山的垂柳(S. babylonca)、紫藤、萧山的龙爪槐、发财树(Pachira macrocarpa)和巴西木。将所采集的幼虫在实验室的培养皿中均用番茹饲养, 直至化蛹。

1.2 DNA提取

取上述源自各种寄主的蔗扁蛾蛹各2头, 分别于液氮中研磨成粉状, 转入1.5 mL离心管中, 加30 μL提取液A(1%SDS, 50mmol·L^-1Tris.HCl, 25 mmol·L^-1NaCl, 25 mmol· L^-1 EDTA), 充分研磨; 65 ℃水浴45 min(中间混匀2次); 加入等体积提取液B(3 mol·L^-1KAc pH 7.2), 冰上放置1 h以上; 12 000 r·min^-1, 10 min离心, 转移上清液至新管; 加入等体积饱和酚, 轻混匀, 12 000 r·min^-1, 10 min离心, 转移上清液至新管; 加入2倍体积预冷无水乙醇, 混匀放置-20 ℃, 1 h以上; 12 000 r·min^-1离心15 min, 小心倾尽上清液, 收集沉淀, 用70%乙醇洗1次; 重复上步骤用70%乙醇洗, 晾干沉淀; 每管加入20 μL水, 充分溶解后用NP-2紫外分光光度计定量测定并用琼脂糖凝胶电泳观察其质量, -20℃保存备用。

1.3 基因组DNA浓度测定

取DNA提取液2 μL稀释到200 μL, 用NP-2紫外分光光度仪测定A260和A280的值, 计算DNA的浓度和质量。

另取2 μL经1.0%琼脂糖凝胶电泳, 与λDNA/Hind Ⅲ比较确定所提取DNA的片段大小。

1.4 内转录间隔区(Internal Transcribed Spacers, ITS)引物设计

通过对NCBI GenBank数据库中有关昆虫18S rDNA和28S rDNA的生物信息学分析, 选择一对保守性强的核酸序列作为蔗扁蛾ITS扩增的PCR引物。

1.5 PCR反应体系和循环参数

ITS1-5.8S rDNA-ITS2片断PCR扩增采用引物OS1和OS2。引物由上海生工生物工程技术服务有限责任公司合成。反应体系为100 μL含1×PCR反应缓冲液、1.5 mmol·L^-1MgCl₂、0.2 mmol·L^-1dNTPs、0.5 μmol·L^-1的1对引物、200 ng模板DNA和5u Taq DNA聚合酶, 扩增反应在MJ Research公司的Minicycler PTC－225型PCR仪上进行, 循环参数为：94 ℃预变性3 min, 然后为25轮循环, 每轮循环在94 ℃变性1 min, 58 ℃退火1 min, 72 ℃延伸2 min, 25轮循环结束后, 在72 ℃延伸8 min, 最后在4 ℃停止反应。

1.6 PCR扩增产物检测

从每一反应中各取8 μL反应液, 加在1%琼脂糖凝胶板上电泳, 经EB染色, 紫外灯下检测PCR扩增物的有效性, 并拍照记录。

1.7 核糖体DNA ITS序列测定

PCR产物用Vitagene DNA清洁试剂盒进行纯化。纯化按Vitagene公司提供的使用方法进行, 纯化后的PCR产物于－20 ℃保存备用。PCR纯化产物直接进行双向测序, 序列测定在浙江大学分析测试中心生物大分子实验室的MegBase 1 000 DNA测序仪上进行。测序引物为OS1和OS2。双向测序结果用SeqMan (DNAStar Inc.)软件进行拼接并输出全序列, 用序列多重对齐软件包CLUSTAL X对序列进行对准。

1.8 基于rDNA ITS序列系统树分析

系统发育分析用ClustalX 1.8, 以膜翅目昆虫Mesochorus sp.为外群, 采用邻接法(neighbor-joining method)构建系统树。

2 结果分析 2.1 蔗扁蛾ITS扩增的PCR引物

通过对NCBI GenBank数据库中与鳞翅目18S rDNA和ITS1有关的核酸序列进行比对分析), 确立了18S近ITS1端-185碱基(bp)处的引物序列(OS1)为5′-TGATTACGTCCCTGCCCTTT-3′。为了验证该引物的设计的可靠性, 将该引物在NCBI中进行短序列Blastn搜索(Search for short, nearly exact matches), 结果表明OS1引物能与昆虫纲中已注册的27目中的3 660个种或亚种中18S rDNA序列中至少19个碱基完全配对。同样鳞翅目28S rDNA和ITS2有关的43条核酸序列进行比对分析, 确立了ITS2端28S区的引物(OS2)为5′-TCCTCCCTGATCTGAGGCCAAC-3′, 经短序列Blastn搜索发现能与鳞翅目中已注册的40条序列中至少19个碱基完全配对。

2.2 蔗扁蛾基因组DNA

蔗扁蛾基因组DNA经1.0%琼脂糖凝胶电泳, 与λDNA/Hind Ⅲ比较, 来自不同寄主的蔗扁蛾基因组DNA长度约为23 kb, 琼脂糖凝胶电泳结果(图 1)表明所提的基因组DNA的质量较好, 多数菌株的A260/A280比值在1.8左右, 适合作进一步的ITS序列的PCR扩增。

2.3 不同寄主蔗扁蛾ITS的PCR扩增

对来自巴西木、发财树、柳树、紫滕和盘槐的5个DNA模板进行PCR扩增, 扩增产物经1.0%琼脂糖凝胶电泳并与标准分子量比较, 其DNA片段长度均为1.2 kb(图 2)。

2.4 序列比对分析

从表 1可见, 来自5种寄主的蔗扁蛾ITS1序列长度为443 bp, ITS2的长度为358 bp, 整个ITS结构区域的长度为987 bp, 可此可计算出PCR扩增的长度应为1 200 bp。各序列的G+C含量差异不显著, 在47.1%~47.5%之间。对各序列间经两两比对表明, 它们相互间高度相似, 相似率均超过99.4%, 与膜翅目姬蜂的相似性仅为55%左右(表 2)。不同寄主中获得的蔗扁蛾ITS序列中的碱基发生改变全部集中在ITS1区和ITS2区, 具体发生改变碱基及其位置见表 3。它们之间的变对上述5个基因组模板进行的系统树分析后构建的系统树(图 3)表明, 尽管来自不同寄主林木, 它们在系统进化上仍然高度一致, 不因寄主林木的改变而有所变化。

3 讨论

18S—28S核糖体DNA基因的内转录间隔区(ITS)作为一种重要的生物物种系统与进化研究的重要分子标记, 这种分子标记常具有种的特异性。蔗扁蛾作为一种重要的检疫性害虫, 明确其具有种特异性的分子标记对于发展除了形态鉴定之外新的鉴定手段是非常必要的。本文在充分利用了18S和28S rDNA重复序列在物种间高度保守的特性, 设计合成了OS1和OS2引物, 经GenBank的Blastn生物信息学分析和实际的PCR扩增试验, 证明这种引物设计思路完全可行。尤其是OS1引物, 通用性非常强, 几乎能覆盖整个昆虫纲的昆虫所注册的ITS序列。

对来源于巴西木、发财树、垂柳、紫藤和龙爪槐的蔗扁蛾的ITS序列分析表明, 蔗扁蛾在长期的进化过程中, 种内的ITS序列的相似性均在99%以上, 几乎没有发生质的变化, 这说明在蔗扁蛾的进化过程中, 寄主植物的影响不是关键因素。明确了蔗扁蛾的ITS序列后, 为作者进一步设计专一性蔗扁蛾种特异性PCR引物提供了生物信息学基础, 并可针对ITS的可变区ITS1和ITS2的序列, 与GenBank中已有的核酸序列进行比对, 从蔗扁蛾的ITS中找出与其他物种尤其是昆虫类序列变异最大的序列区域作为蔗扁蛾专一性引物的参照。对设计合成的系列引物进行尽可能的广泛验证并不断完善。当然从理论上要设计一对或若干对种特异性引物并不难, 关键是要经过大量的实践检验, 这是费时、费力和费钱的工作。