紫椴(Tilia amurensis)种群是东北植被区红松阔叶林群落的主要伴生种群及人工天然复合群落的优良混交组分(聂绍荃等, 1992)。紫椴用途广泛, 经济价值高, 不仅是重要的蜜源树种(徐万林, 1983), 而且是优质胶合板及细木加工的重要树种。在国务院批准的《国家重点保护野生植物名录(第一批)》中, 紫椴被列为国家Ⅱ级保护植物。目前, 关于紫椴的研究主要集中在种群生态(聂绍荃等, 1992)、育种造林(邹学忠等, 1995)、种子解剖(杜凤国等, 1994)等方面, 而对于其分子生物学方面的研究尚属空白。

ISSR(Inter-Simple Sequence Repeat)又称简单序列重复区间扩增, 是近年来在微卫星技术上发展起来的一种新型分子标记技术。由于具有多态性高, 稳定性好, 不需预知基因序列, 检测快速, 产物特异性强, DNA用量少, 技术要求低, 技术成本低等特点(段昌群, 2004), 现已在物种的遗传多样性与遗传结构(Barth et al., 2002)、无性系植物的遗传多样性(Esselman et al., 1999)、物种形成和种质鉴定(Andrea et al., 1998)等研究领域得到了广泛应用。不足之处在于稳定性易受到Taq酶、Mg²⁺、引物、退火温度等多个因素的影响, PCR扩增的最适反应条件需要一定时间摸索。因此, 在利用ISSR技术进行遗传多样性分析时, 为保证结果的清晰、可靠和准确, 必须对反应体系进行优化。

目前, 对ISSR-PCR反应体系进行优化主要采用单因子试验和正交设计2种方法。单因子试验是指分别研究影响因素对ISSR-PCR反应的影响情况, 找出各自的合适条件, 通过各因素的组合建立ISSR-PCR反应的最优体系。目前, 此方法已被广泛应用于PCR反应体系的优化中。何正文等(1998)首次将试验统计学上的正交设计应用到PCR反应体系优化中, 综合考查各因素及其交互作用并快速找到影响因素的最佳水平组合。此后, 谢运海等(2005)、王彦华等(2004)也采用正交设计分别对水曲柳(Fraxinus mandshurica)和不结球白菜(Brassica campestris ssp. chinensis)的ISSR-PCR反应体系进行了优化, 确立了较为可靠的反应体系。

本研究分别采用2种方法对影响紫椴ISSR-PCR反应体系的4个主要因素(Taq酶用量、Mg²⁺浓度、dNTP浓度、引物浓度)在3个水平上进行优化试验, 通过对2种试验方法的综合比较与分析, 选取最佳因素水平, 建立紫椴ISSR-PCR最佳反应体系, 并为今后PCR反应体系优化方法的选择提供必要参考。同时, 根据最佳体系筛选出14个扩增稳定、多态性丰富的ISSR引物, 通过梯度PCR确定引物的最佳退火温度。最后, 对扩增反应的延伸时间以及循环次数进行优化, 得到了紫椴ISSR-PCR反应的最佳扩增程序, 为今后紫椴地理种源的群体遗传多样性研究及系统保护提供分子水平上的借鉴与参考。

1 材料与方法 1.1 材料

2004年10月底采集辽宁省凤城市, 吉林长白山国家自然保护区, 黑龙江省宁安市、勃利县、伊春市和内蒙古自治区大杨树林业局6个地区紫椴的1年生枝条, 样本个体间距大于50 m, 置于实验室内水培, 采集新生叶片, 置于-20 ℃冰箱中备用。

1.2 主要试剂及仪器

用于ISSR-PCR反应的dNTP、Taq酶、标准分子量(Marker)DL2000购自TaKaRa公司, Mg²⁺购自MBI Fermentas。引物参照加拿大哥伦比亚大学(UBC)提供的ISSR引物序列(张青林等, 2004), 上海生工公司合成。PCR反应在美国MJ公司的PTC-200型PCR循环仪上进行。试验于东北林业大学林木遗传育种学科实验室内完成。

1.3 方法 1.3.1 基因组DNA提取

采用改良的CTAB法(王军等, 2000)提取基因组DNA, 0.8%琼脂糖凝胶电泳检测, Eppendorf公司生产的Bio Photometer核酸检测仪检测DNA溶液浓度与纯度, 并将浓度稀释至30 ng·μL^-1。

1.3.2 ISSR-PCR反应因素水平的确定与正交表的设计

针对影响PCR反应的Taq酶、Mg²⁺、dNTP、引物4个因素, 选用L₉(3⁴)正交表在3个水平上试验。引物为810(GA)₈T, 参加PCR反应的因素水平见表 1, L₉(3⁴)正交设计方案(王希田等, 1999)见表 2。

将表 2的9个处理重复3次, 进行扩增反应。反应体系总体积为20 μL, 除上述变化因素外, 还含有1×PCR buffer, 30 ng模板DNA。反应条件参考红松(Pinus koraiensis)ISSR-PCR反应程序(冯富娟等, 2004):94 ℃预变性5 min, 94 ℃变性30 s, 52 ℃退火45 s, 72 ℃延伸2 min, 循环40次, 72 ℃延伸7 min, 4 ℃保存。PCR产物用1.5%琼脂糖凝胶电泳检测, EB染色, Gene Genius公司的Bio Imaging System成像。对结果进行直观分析, 得到紫椴ISSR-PCR反应各影响因素的最佳水平。

1.3.3 单因子试验

根据表 1中各影响因素水平分别研究4个因素对ISSR-PCR反应体系的影响, 每个因素水平做3次重复。ISSR-PCR反应体系及扩增程序与正交试验相同, PCR产物用1.5%琼脂糖凝胶电泳检测, EB染色, Gene Genius公司的Bio Imaging System成像。对结果进行直观评价, 并与正交试验结果进行比对, 建立紫椴ISSR-PCR反应的最佳体系。

1.3.4 引物筛选

从6个种源中分别选取2个模板, 在优化好的反应体系中进行扩增筛选。

1.3.5 退火温度的确定

根据所选引物序列计算理论退火温度Tm, Tm = 4(G+C)+2(A+T)(卢圣栋, 1999), 设定退火梯度[(Tm±6)℃], 仪器自动形成1~12个梯度, 确定最佳退火温度。

2 结果与分析 2.1 PCR正交设计直观分析

根据L₉(3⁴)正交试验PCR产物电泳结果(图 1), 按照遗传多样性分析要求, 对PCR扩增结果从高到低依次打分。条带数量丰富、清晰度高的最佳产物记为9分, 与此相反, 最差的记为1分。9个组合的分数依次为:6、7、5、4、9、2、8、1、3。根据分数求出每个因素同一水平下的试验值之和K_i以及每一因素水平下的数据平均值k_i, 并求出同一因素不同水平间平均值的极差R(表 3)。

极差R反映了影响因素对反应体系的影响情况, R越大, 影响越显著。由表 3可知各因素水平的变化对紫椴PCR反应的影响从大到小依次为:dNTP、Mg²⁺、引物、Taq酶。

每一因素水平下的数据平均值k_i反映了影响因素各水平对反应体系的影响情况, k_i值越大, 反应水平越好。由表 3可知ISSR-PCR反应中4个影响因素的最佳反应水平为:Taq酶1.0 U, Mg²⁺2.0 mmol·L^-1, dNTP 0.25 mmol·L^-1, 引物0.3 μmol·L^-1。4个因素的最佳水平组合并没有在正交表中出现, 但与分值最高的5号组合接近, 仅Taq酶的用量不同。因此, 在使用正交设计进行反应体系优化时, 可根据电泳结果直接选择, 不经过直观分析, 也能够得到较好的反应体系。

2.2 单因子试验结果分析 2.2.1 Taq酶用量对ISSR-PCR的影响

酶的用量是影响PCR的一个重要因素, 浓度过低不能扩增, 浓度太高产生非特异性扩增。本试验从1.0 U, 1.5 U, 2.0 U 3个水平分别进行扩增(图 2), 发现3个Taq酶用量所得到的扩增结果不一致, 随着Taq酶用量的增加, 多态性逐渐降低, 扩增条带减弱, 清晰度下降。当Taq酶用量为1.0 U时, 扩增条带明显好于其他2个水平, 这与正交试验中Taq酶的最佳水平相一致。因此确定1.0 U为ISSR-PCR反应体系中Taq酶的最佳用量。

2.2.2 dNTP浓度对ISSR-PCR的影响

dNTP是PCR的原料, 浓度过高会产生错误掺入, 浓度太低导致产率下降。从图 3中可以看出, dNTP浓度为0.15 mmol·L^-1时不能扩增相对分子质量较大的条带, 浓度为0.25 mmol·L^-1时扩增条带弱。浓度为0.20 mmol·L^-1时条带清晰, 多态性好, 为反应最优水平。而在正交试验中dNTP的最佳浓度为0.25 mmol·L^-1, 且3个水平间的差异显著。由于ISSR-PCR反应体系中每种dNTP的终浓度在0.02~0.20 mmol·L^-1范围内时, PCR产物量、特异性与合成忠实性间的平衡最佳(周延清, 2005)。因此选择0.20 mmol·L^-1作为ISSR-PCR反应体系中dNTP的最佳浓度。

2.2.3 Mg²⁺浓度对ISSR-PCR的影响

Mg²⁺浓度是影响PCR结果的重要因素之一。Mg²⁺不仅影响Taq酶活性, 还能与反应液中的dNTP、引物及模板相结合, 影响引物与模板的结合效率、产物特异性及引物二聚体的形成(席嘉宾等, 2004)。从图 3中可以看出Mg²⁺浓度在1.5、2.0、2.5 mmol·L^-1 3个水平间扩增无显著差异, 同时正交试验结果表明Mg²⁺浓度在1.5和2.0 mmol·L^-1时对PCR反应结果影响基本一致。因此选择2.0 mmol·L^-1作为ISSR-PCR反应体系中Mg²⁺的最佳浓度。

2.2.4 引物浓度对ISSR-PCR的影响

引物浓度关系到扩增产物的质量, 浓度偏高会引起错配和非特异性产物扩增, 增加引物二聚体的形成几率。浓度太低则无法进行有效扩增。从图 4中可以看出在各引物浓度下, 都能扩增出一致的条带, 随着引物浓度的升高, 扩增条带由弱到强。当浓度为0.4 μmol·L^-1时, 反应稳定, 条带清晰。在正交试验中引物浓度在0.3与0.4 μmol·L^-1时平均值k_i十分接近, 说明2个水平对反应体系的影响无明显差别, 因此选择0.4 μmol·L^-1作为ISSR-PCR反应体系中引物的最佳浓度。

综上所述, 本试验得到紫椴ISSR-PCR反应的最佳体系:TaqDNA聚合酶1.0 U, Mg²⁺ 2.0 mmol·L^-1, dNTP 0.20 mmol·L^-1, 引物0.4 μmol·L^-1, 1×PCR buffer, 30 ng模板DNA。用其对紫椴群体的模板DNA进行扩增, 取得了较好的扩增效果(图 4)。

2.3 引物筛选及退火温度的确定

ISSR-PCR扩增, 退火温度明显影响扩增谱带式样(姜静等, 2003)。而有些研究学者则认为, 不论引物组成如何均采用50~52 ℃退火温度, 也能获得清晰的谱带(邹喻苹等, 1998)。本试验根据紫椴ISSR-PCR反应的最佳体系, 从100个ISSR引物中筛选出14个扩增稳定、重复性强的引物用于PCR扩增(表 4)。再针对筛选出的引物逐个进行梯度退火试验, 确定引物的最佳退火温度(表 4)。图 5为引物815(CT)₈ G的梯度退火PCR, 从图中可以看出, 退火温度过低, 扩增特异性差, 杂带较多, 背景深; 退火温度过高, 引物与模板结合差, 电泳条带弱, 甚至没有扩增。对其他引物进行梯度PCR, 也得到同样结果。在选择最佳退火温度时, 如扩增结果相近, 宜选择较高退火温度, 以提高反应的特异性。

2.4 延伸时间对ISSR-PCR的影响

在ISSR-PCR反应中延伸温度一般为72 ℃, 除了退火温度外, 延伸时间是另外一个重要的影响因素。延伸时间的长短与扩增片断的长度呈正相关(冯富娟等, 2004)。时间过短, 无法完成扩增, 产量低; 时间过长, 会产生非特异扩增。本试验进行了45 s、1 min、1.5 min和2 min 4种尝试, 发现在2 min时, 获得了稳定扩增, 并且在250 bp明显扩增出了多态性条带。因此, 在本研究中采用2 min的延伸时间。

2.5 循环次数对ISSR-PCR的影响

选择适宜的循环次数将会获得良好的扩增图谱。从理论上说, 循环次数越多, 扩增产物产率越高, 但实际上会受到各反应成分的用量限制。在原来的反应程序的基础上, 其他条件不变, 分别试验了30、35、40、45个循环对扩增结果的影响。发现随着循环次数的增加, 扩增产物的量也增多, 相比之下, 40个循环得到的条带强弱合适, 清晰可辨, 为最佳循环次数。

3 讨论

ISSR-PCR反应对模板浓度的要求范围较宽。冯富娟等(2004)在进行红松ISSR-PCR反应体系优化时证实模板纯度不会影响扩增结果, 模板浓度在10~200 ng·μL^-1之间扩增结果相同。因此, 本研究在进行优化时没有考虑模板纯度和浓度对反应体系的影响, 而是直接采用30 ng·μL^-1作为模板浓度进行PCR扩增, 取得了良好的扩增效果。

本研究针对目前常见的2种ISSR-PCR试验方法进行反应体系优化, 发现利用正交设计直观分析法, 能够迅速获得满意的试验结果。但该方法也存在一定的局限性, 如对试验结果本身的评价带有主观成分, 打分的先后次序直接影响分析结果, 使影响因素最佳反应水平的确定缺乏可靠性。本试验在正交设计中认为dNTP浓度对反应体系影响最大, Taq酶影响最小。而在单因子试验中则发现dNTP、Taq酶和引物对反应体系均有显著影响, Mg²⁺浓度变化对反应体系的影响不显著。此外, 2种方法所得到的因素最佳水平也不完全相同, 这既与PCR反应的不稳定性有关, 也与正交设计采用的主观打分有关。虽然正交设计采用直观分析, 有的研究(谢云海等, 2005)还采用方差分析法对试验结果进行分析, 但这仍不可避免由主观打分所造成的试验误差。因此, 如果能对PCR扩增结果建立客观的评价标准, 将会更好地促进该方法的应用。