目前普遍采用化学方法测定植物叶片中N和叶绿素含量, 其中测定N含量的方法包括凯氏定N法和气相色谱法等, 测定叶绿素是使用不同溶剂(酒精、丙酮和二甲基亚砜等)萃取叶绿素进行吸光度测定, 这些方法费时费力而且对叶片具有破坏性。在生理生态学研究中往往需要大量重复测定样品, 这些已有的破坏性方法往往难以满足实验需要(Ichie et al., 2002)。最近, 已经开发出新型的叶绿素测定仪如日本的SPAD-502叶绿素测定仪, 以及N含量测定仪如日本佐竹(Satake)公司的Agriexpert PPW-3000。本文选择我国东北哈尔滨地区本土树种华北紫丁香(Syringa oblata)、山槐(Maackia amurensis)和1个引进树种紫穗槐(Amorpha fruticosa), 对使用SPAD-502和PPW-3000测定叶绿素和N含量变化的可行性进行了研究。

研究地点位于黑龙江省哈尔滨市东北林业大学校园内植物标本园。本地区属于典型寒温带季风大陆性气候, 夏季炎热多雨, 冬季寒冷时间持续较长, 春季和秋季很短。树木叶片开放和衰老脱落过程都表现得相当迅速, 一般乔木叶片衰老脱落过程仅需要10~30 d(东北林业大学, 1984)。测定期间(2003-09-22—2003-10-26)平均气温为10.7 ℃, 最高气温为18.0 ℃, 最低气温为2.7 ℃。空气平均相对湿度62.7%, 最低湿度为20%。

选取2个本地种华北紫丁香、山槐和1个引进种紫穗槐为研究材料。

使用SPAD-502叶绿素测定仪(Minolta, Japan)和Agriexpert PPW-3000叶片N含量测定仪(Satake, Japan), 从2003-09-22—2003-10-26每隔1~2 d对3种叶片测定1次。每种叶片3个重复, 每个叶片选取20个不同的位置进行测定。测定结束后, 采摘测定叶片于室内用标准方法进行叶绿素和N含量分析。以上每次测定的平均值代表每个种用于拟合计算(见表 1~3)。

表 1 3种植物叶片单位鲜质量N含量、单位面积N含量与PPW-3000、SPAD-502测定值的相关关系 Tab.1 Relationship between readings from PPW-3000 and SPAD-502 and nitrogen content based on leaf area and fresh mass

表 1 3种植物叶片单位鲜质量N含量、单位面积N含量与PPW-3000、SPAD-502测定值的相关关系 Tab.1 Relationship between readings from PPW-3000 and SPAD-502 and nitrogen content based on leaf area and fresh mass

表 2 3种植物叶片叶绿素a, b和a+b含量(分别以叶片单位面积和单位鲜质量为基础)与SPAD-502测定值的相关关系 Tab.2 Relationship between contents of chlorophyll a, b and a+b based on leaf area and leaf fresh mass and readings from SPAD-502

表 2 3种植物叶片叶绿素a, b和a+b含量(分别以叶片单位面积和单位鲜质量为基础)与SPAD-502测定值的相关关系 Tab.2 Relationship between contents of chlorophyll a, b and a+b based on leaf area and leaf fresh mass and readings from SPAD-502

表 3 3种植物叶片叶绿素a, b和a+b含量(分别以叶片单位面积和单位鲜质量为基础)与PPW-3000测定值的相关关系 Tab.3 Relationship between chlorophyll a, b and a+b based on leaf area and leaf fresh mass and readings from PPW-3000 for the 3 species

表 3 3种植物叶片叶绿素a, b和a+b含量(分别以叶片单位面积和单位鲜质量为基础)与PPW-3000测定值的相关关系 Tab.3 Relationship between chlorophyll a, b and a+b based on leaf area and leaf fresh mass and readings from PPW-3000 for the 3 species

叶绿素测定采用二甲基亚砜(DEMSO)浸提法(Barnes et al., 1992; Shinano et al., 1996)。叶片N含量采用NC-900碳氮气相色谱分析仪(Shimadzu, Kyoto, Japan)测定。叶片N和不同叶绿素的含量分别以叶面积和叶鲜质量来表示。

数据相关系数的回归显著性采用F检验。数据差异性采用Duncan多重比较。所有分析使用Excel 2003和SPSS11.5完成。

以叶面积为基础表示叶片N含量时, 3种植物叶片N含量与PPW-3000读值显著相关(R²=0.65, p < 0.001);高于其与SPAD-502的相关程度(R²=0.56;p < 0.001)(图 1)。但是当以鲜质量为基础表示叶片N含量时, 其与PPW-3000读值(R²=0.22, p=0.004)及与SPAD-502读值的相关程度(R²=0.04;p=0.16)明显降低。因此, 就便携式仪器与其实测值相关程度来看, 2种便携式测定仪读值能够代表以叶面积为基础的叶片N含量。

图 1 3种植物叶片单位面积N含量与PPW-3000测定值(左)和SPAD-502测定值(右)的相关关系 Fig. 1 Relationship between leaf nitrogen per unit leaf area and reading values from PPW-3000(Left) and SPAD-502(Right)

分别不同植物对PPW-3000和SPAD-502测定值与叶片实际N含量进行回归分析发现, 华北紫丁香叶片的相关系数R²都在0.81以上, 山槐的相关系数R²都在0.84以上。说明2种便携式仪器对于野外测定华北紫丁香和山槐叶片衰老过程中的叶片N含量变化都是有效的。对于紫穗槐, 只有PPW-3000测定值与单位面积N含量呈显著相关, 但相关系数明显低于其他2种植物(R²=0.66;p < 0.001);而单位鲜质量N含量与PPW-3000测定值、2种单位基础的N含量与SPAD-502读值的相关水平很低, 没有达到显著水平(p>0.05)(表 1)。可以看出, 尽管2种便携式仪器对于测定植物在衰老过程中叶片N含量有一定的普适性(R²=0.56~0.65)(图 1), 但是对于求算某一特定植物的N含量的实际值需要建立标准校正曲线。同时, 华北紫丁香和山槐的各项相关系数明显高于相对应的紫穗槐(表 1)。

Ichie等(2002)研究了使用PPW-3000和SPAD-502测定4种落叶树木和6种常绿植物叶片N含量的可行性, 结果发现PPW-3000能够比较理想地表征其中9种植物的叶片N含量, 而SPAD-502能够表征其中6种植物的叶片N含量。本试验结果也发现, 2种便携式仪器能够对所测定的3种植物中的2种进行有效表征, 只有PPW-3000能够表征另外一种植物单位面积叶片N含量(表 1)。PPW-3000和SPAD-502对于表征华北紫丁香和山槐叶片N含量变化的有效性没有明显差异(表 1)。

本研究发现, SPAD-502能够有效表征所测的3种木本落叶植物单位叶面积上不同叶绿素含量(图 2), 但是叶绿素实际值以单位鲜质量表示时, 这种相关系数明显降低(R² < 0.11), 而且相关系数没有达到显著水平(p>0.01)。因此, SPAD-502值能够较为普遍地反映单位面积上叶绿素含量。

图 2 SPAD-502测定值与单位叶面积上3种植物不同种类叶绿素含量的相关关系 Fig. 2 Relationship between readings from SPAD-502 and chlorophyll a, b and a+b based on leaf area for the 3 species 样本总数为48, 回归显著性水平p < 0.001。 Sample number was 48, and significance level is p < 0.001.

分别华北紫丁香、山槐和紫穗槐3个树种表示叶绿素实际含量与SPAD-502值发现, 华北紫丁香叶片SPAD-502值与叶片单位面积上叶绿素a、b和a+b的含量呈显著正相关(R²>0.87), 而与单位鲜质量中的含量的相关系数明显降低(R²>0.56)。与此类似, 山槐SPAD-502值与单位面积上叶绿素含量的相关程度明显高于与单位鲜质量中叶绿素含量的相关程度, 尤其是叶绿素b(表 2)。单位面积和单位鲜质量这2种表示方法中, 紫穗槐各种叶绿素实际含量与SPAD-502值的相关性都较低, 尽管相关性都达到了显著性水平(表 2)。说明SPAD-502在测定叶片衰老过程中叶绿素含量变化的实用性方面存在一定的种间差异性。

与SPAD-502测定值相似, PPW-3000测定值与3种植物单位叶面积上叶绿素含量的相关性较高(R²>0.57;p < 0.001), 而当叶绿素含量以单位鲜质量来表示时, 相关系数R²明显降低到0.27~0.37。因此, 与SPAD-502相似, PPW-3000测定仪也能够更好地表示单位叶面积上叶绿素的含量, 而且在不同植物间具有一定的普适性, 但是种间差异也较大。分别华北紫丁香、山槐和紫穗槐3个树种表示叶绿素实际含量与PPW-3000值发现, 华北紫丁香叶片PPW-3000值与叶片单位面积上叶绿素a、b和a+b的含量呈显著正相关(R²>0.82), 而与单位鲜质量中的含量的相关系数明显降低(R²>0.59)。与此类似, 山槐PPW-3000值与单位面积上叶绿素含量的相关程度明显高于单位鲜质量中叶绿素含量, 尤其是叶绿素b(表 3)。总体来看, 2种叶绿素单位表示方法中, 紫穗槐各种叶绿素实际含量与PPW-3000值的相关性都较低, 尽管相关性都达到了显著性水平(表 3)。说明与SPAD-502测定结果类似, PPW-3000在测定叶片衰老过程中叶绿素含量变化的实用性方面存在一定的种间差异性。

如图 1、图 2和图 3所示, PPW-3000和SPAD-502对于表征叶片N含量和各种叶绿素含量具有一定的普适性, 特别是表征单位叶面积上叶绿素含量和N含量。然而, 尽管回归都达到显著性水平(P < 0.01), 但相关系数并不是很高, R²在0.51~0.65。这一相关程度是否足以用来表征不同植物叶绿素和叶片N含量水平的差异呢？为此, 综合数据用于比较化学方法和便携式仪器测定结果是否一致(表 4)。需要指出的是, 由于早期测定的值和后期测定的值存在显著的差异(图 4), 为了避免统计学上的处理内部方差(早期测定与后期测定)明显大于处理间(不同植物)方差所造成的方差比较不显著, 选择10月2日之前, 即叶片都未褪色之前测定的值综合进行统计分析(图 4)。由表 4可以看出, 叶绿素实际值的顺序是华北紫丁香显著高于紫穗槐和山槐, 而后两者差异不显著, 这一趋势对于叶绿素a、b和a+b相同; 叶片N含量实际值为华北紫丁香>山槐>紫穗槐, 但差异不显著。相对指标SPAD-502值测定结果为山槐>华北紫丁香>紫穗槐, 差异全部达到显著水平; PPW-3000测定值山槐>华北紫丁香>紫穗槐, 其中, 紫穗槐显著低于山槐和华北紫丁香, 而后二者差异不显著(表 4)。因此, 可以看出, 不论从平均值本身还是从差异的统计分析结果来看, 直接使用便携式仪器进行种间叶绿素和N含量比较的可行性较差。

图 3 PPW-3000测定值与单位叶面积上3种植物不同种类叶绿素含量的相关关系 Fig. 3 Relationship between readings from PPW-3000 and contents of chlorophyll a, b and a+b based on leaf area for the 3 species 样本总数为38, 回归显著性水平p < 0.001。 Number of total samples is 38, and significance level is p < 0.001.

表 4 PPW-3000和SPAD-502用于种间比较的可行性(测定日期:9月22日—10月2日)^① Tab.4 Practicability of using the PPW-3000 and SPAD-502 for interspecies comparison (from Sep.2 to Oct. 2)

表 4 PPW-3000和SPAD-502用于种间比较的可行性(测定日期:9月22日—10月2日)① Tab.4 Practicability of using the PPW-3000 and SPAD-502 for interspecies comparison (from Sep.2 to Oct. 2)

图 4 引进种紫穗槐与本地种华北紫丁香、山槐叶片衰老过程中总叶绿素含量(左)和N含量(右)变化的差异性 Fig. 4 Difference in the change of chlorophyll a+b(Left) and N content(Right) during the process of leaf autumn senescence between introduced species of A.fruticosa and local species of S. oblata and M.amurensis

综合表 1、表 2和表 3可以看出, 对于华北紫丁香和山槐, 2种仪器都适用于表征其叶片衰老过程中不同种叶绿素和N含量的变化, 特别是表征单位叶面积上的含量, 相关系数R²在0.82以上。但是对于紫穗槐, 2种仪器对于叶片衰老过程中叶绿素含量和N含量的表征效果并不很好, 即使是表征单位叶面积上的含量, 相关系数R²最高才0.66, 甚至有些回归没有达到显著性水平。是什么原因造成相同仪器测定不同植物叶片衰老过程中叶绿素和N含量变化有如此大的差异呢？

我国东北地区天气特点是冬夏时间长, 而春秋时间短, 按照叶片衰老过程中叶绿素变化, 我国东北落叶树木可以分为2类, 一类是叶片在秋季衰老过程中叶绿素降解与叶片水分丧失和脱落同步发生, 表现为随着秋季温度降低, 叶片很快变黄, 代表树种为大部分乡土树种, 如华北紫丁香、山槐、落叶松、水曲柳等; 另一类是叶片失水在先而叶绿素降解往往滞后, 表现为叶片尽管已经干枯, 叶子绿色尚未褪, 甚至干枯的绿叶也能在树上暂存一段时间, 代表树种大部分为从华北引进的树种, 如紫穗槐和杨柳科植物旱柳(Salix matsudana)和银中杨(Populus alba×P. berolinensis)等。对紫穗槐、华北紫丁香和山槐测定结果表明了这一特征(图 4)。本地种华北紫丁香和山槐的叶绿素含量于10月2日后急剧下降, 至落叶前叶绿素含量最高仅为测定初期的30%;而引进种紫穗槐从测定初期到大部分叶片脱落, 叶绿素含量几乎没有变化。叶片N含量也表现出相似的特征, 本地种表现为明显的N元素回收于植物体的特征, 而引进种的回收再分配量相对少很多(图 4)。外地引进种由于没有适应本地区的气候, 所以表现在叶片衰老死亡过程中没有明显的叶绿素变化和N元素回收利用, 这一方面致使紫穗槐的测量区间较其他2种小, 导致回归分析过程中相关系数较小。另一方面, 不论是SPAD-502还是PPW-3000, 其测定过程中重要的一部分是测定叶绿素及其相关的含N物质的吸收峰, 由于紫穗槐叶绿素变化很小, 所以只能测定叶绿素吸收峰(650 nm)的SPAD-502就很难测定N含量变化(表 1), 而PPW-3000由于可以测定类胡萝卜素和花青素吸收光线的峰区(560 nm)、叶绿素吸收峰(660 nm)和甲基的蛋白质的吸收峰(900 nm)(Manetas et al., 1998; Ichie et al., 2002), 所以更能够表征像紫穗槐这样的叶片N含量变化(表 1)。叶绿素相关的N元素在叶片正常衰老(如华北紫丁香和山槐)过程中的迁移量是最大的, 这可能是SPAD-502和PPW-3000对N和叶绿素测定结果在多数情况下相当的原因(表 1, 2和3)。因此, 建议至少在测定本地种正常叶片衰老过程中N含量变化时, SPAD-502可以取代PPW-3000。

使用PPW-3000和SPAD-502便携式仪器能够有效表征华北紫丁香和山槐叶片衰老过程叶绿素和N含量变化, 但是对于从外地引进树种, 叶片衰老脱水过程中叶绿素并未同时分解的叶片表征效果较差(如紫穗槐)。尽管2种仪器对于同一种植物不同生长时期叶片N和叶绿素含量的变化表征效果较好, 但是对种间比较的效果较差。因此, 使用2个便携式测定仪准确估计N素和叶绿素含量需要首先确定每种植物的标准校正曲线。此外, 2种便携式仪器表征单位叶面积上不同叶绿素和N含量的效果较佳, 而对于表征单位鲜质量叶片叶绿素和N含量的效果较差。2种仪器比较而言, PPW-3000对于表征叶片N含量变化, 尤其是对于叶片衰老脱水过程中叶绿素并未同时分解的叶片(如紫穗槐), 效果较SPAD-502好, 而对于正常叶片衰老过程中叶绿素的变化(如华北紫丁香和山槐), 2种仪器效果没有明显区别。