光肩星天牛(Anoplophora glabripennis)属鞘翅目(Coleoptera)天牛科(Cerambycidae)，英文名为asian longhorned beetle(ALB)，是一种重要的蛀干害虫, 在中国北部为害严重，对三北防护林造成了严重危害。1996年在美国纽约和芝加哥相继发现该虫，危害包括槭树(Acer spp.)和榆树(Ulms spp.)在内的许多种树木，认为该虫是从中国传入的，并对我国出口货物木质包装采取紧急检疫措施，给我国对外贸易造成了巨大损失¹⁾。由于光肩星天牛的经济重要性，国内外发表了大量关于光肩星天牛的研究论文，但研究多侧重于其形态特征、危害情况，对其遗传进化、系统分类关系等方面的研究相对较少。线粒体DNA(mtDNA)序列是目前研究昆虫系统发育、种群遗传变异和分化，以及鉴定难以用外部特征区别的近缘种等研究中应用较广的遗传物质，在昆虫系统发育中已多有研究(徐庆刚等，2001；张方等，1998)，其中COⅠ基因的应用最为广泛(罗晨等，2002；任竹梅等，2003；Anthony et al., 2000；Beckenbach et al., 1993)。为了解光肩星天牛种群间的关系，本研究采集了不同国家、地区的光肩星天牛及其近源种样品，并对其线粒体DNA COⅠ基因部分序列进行了测定和分析，以揭示美国、韩国及中国各地光肩星天牛之间的遗传关系。

1) 国家质量监督检验检疫总局.2004.输往中国货物木质包装传带有害生物的风险分析报告

1 材料与方法 1.1 样品采集

本研究采集了不同地理来源的24个光肩星天牛样品和4个不同地理来源的黄斑星天牛样品，以及8个近缘种和花曲柳窄吉丁，共37个样品，用于mtDNA测序, 每个样品测序3~4个个体，以检验测序的准确性(表 1)。

1.2 DNA提取

参照安榆林等(2004)论文中DNA的提取方法。样品为幼虫时，从腹面剖开虫体，剥掉消化道，用9 g·L^-1的生理盐水洗净虫体，剪碎；样品为成虫时，剖开虫体，取胸部肌肉剪碎。移取少许样品碎沫到玻璃匀浆器中，加入1 mL SDS消化液(20 mmol·L^-1 Tris-Cl，pH 7.4；20 mmol·L^-1 EDTA，pH 8.0；0.5%SDS)，充分匀浆，将混合液移入小塑料管内，加30 μL 20 mg·mL^-1的蛋白酶K，摇匀，在50~55 ℃的水浴锅中消化过夜；水浴消化后，12 000 r·min^-1离心5~10 min，取上清；加入酚和氯仿/异戊醇各0.5 mL，充分摇匀，12 000 r·min^-1离心10 min，取上清，并重复此步骤一次；加入1 mL的氯仿/异戊醇，摇匀，离心(12 000 r·min^-1)10 min，取上清；加入相当于上清液2倍体积的无水乙醇(约1 mL)及0.1倍体积的醋酸钠(约50 μL)，轻轻摇匀，置于-20 ℃冰箱中至少沉淀DNA 2 h；沉淀后，离心(12 000 r·min^-1) 10 min，倒掉水相，每管加入300 μL 70%乙醇进行漂洗，再离心(12 000 r·min^-1) 10 min，倒掉乙醇，然后让其在空气中或置于35 ℃左右的烘箱中晾干；将沉淀物溶于50 μL 1×TE(pH 8.0)中(可置于50~60 ℃水浴3~5 min)；于-20 ℃冰箱中存贮，用于PCR扩增。

1.3 mtDNA扩增及测序

本研究采用通用引物J-1718和N-2191扩增mtDNA COⅠ基因长度约504 bp的片断，通用引物序列为J-1718 5′-GGA GGA TTT GGA AAT TGA TTA GTT CC-3′和N-2191 5′CCC GGT AAA ATT AAA ATA TAA ACT TC-3′。

PCR反应总体积为50 μL：ddH₂O 31.5 μL，10×Buffer 5 μL，25 mmol·L^-1 MgCl₂ 4 μL，2.5 mmol·L^-1 dNTP 4 μL，正反引物各1 μL，2 μL BSA，及0.5 μL Taq酶，1 μL DNA。在MJ research 200 PCR仪上进行PCR扩增：95 ℃ 5 min, 然后进行35个循环, 94 ℃ 30 s，47 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min, 最后72 ℃ 5 min。

每一样品取约500 ng产物DNA，分别以正向或反向引物进行Bigdye测序反应，并用ABI 3 700DNA自动测序仪分析获取DNA序列结果。

1.4 序列分析

用CLUSTALX软件将DNA序列对齐，保留454 bp。对所有样品DNA序列进行比对，显示出DNA序列的差异位点。

1.5 NJ系统树分析

使用Sinauer Associates，Inc.开发的PAUP*4.0软件进行DNA序列排序并产生NJ系统树，设定花曲柳窄吉丁(JD)为外缘种。

2 结果与分析 2.1 序列测定结果

用CLUSTALX软件将DNA序列对齐后，保留了454 bp，部分测序结果发表在Genbank上(登录号见表 1)。测序结果表明：该基因片断在种间差异明显，光肩星天牛与星天牛和四川星天牛、松墨天牛、黄星天牛、花曲柳窄吉丁之间存在明显差异。光肩星天牛与四川星天牛(AFSC、AFSC1)间存在35 bp差异，占总测序碱基数的7.7%；与星天牛间的差异达33 bp以上；与松墨天牛的差异达60 bp，占碱基总数的13.2%；与黄星天牛差异75 bp，占碱基总数的16.5%；与花曲柳吉丁差异达95 bp，占碱基总数的20.9%。而星天牛和四川星天牛之间差异较小；星天牛种群间存在一定的碱基差异。光肩星天牛在该基因片断相对保守，差异在0~2.6%之间，最大碱基差异为12个；光肩星天牛样品与黄斑星天牛样品间的碱基差异也较小，为0~2.4%，碱基最大差异为11个。从DNA序列来看(图 1)，所有黄斑星天牛样品在该片段DNA序列的差异不超过光肩星天牛样品之间的差异，其中，河北及甘肃的黄斑星天牛样品与河北、甘肃光肩星天牛样品DNA序列无任何差异。

光肩星天牛(包括黄斑星天牛)mtDNA COⅠ基因这一片断，与其他天牛种类相比，具有高度的特异性和稳定性。中国、美国及韩国光肩星天牛16个样品间有9个碱基差异，这9个碱基具有规律性，可视为标记性碱基；另有6个碱基差异仅表现在个体间，无规律性。上述9个标记性碱基分别位于图 1所列DNA序列的44、70、76、220、233、236、310、334、394位点处。在这9个碱基中，美国与韩国光肩星天牛样品间有4个共有碱基；美国与中国的样品间有3~5个共有碱基；韩国与中国样品有1~3个共有碱基。其中，美国光肩星天牛样品在44、70位点处各有一个C、T，而韩国光肩星天牛在44、70位点处也各有一个C、T，在220至240位点之间有3个碱基变化，在334位点处有一个碱基C。中国光肩星天牛在44、70位点处却不具有一个C、T。

中国甘肃、河北、内蒙古、陕西光肩星天牛及甘肃、河北黄斑星天牛在78位点处均有一个G，而其余则为A；中国宁夏、浙江、安徽、湖北、山东的光肩星天牛及宁夏、山西黄斑星天牛则在232位点处有一个C，在310位点处有一个G，在394位点处各有一个C。上述中国各地的光肩星天牛明显分为2群，2群之间有4个标记性碱基差异。

2.2 系统进化树

以花曲柳窄吉丁为外缘种应用Paup*4.0软件对测序结果构建了NJ系统树(图 2)。光肩星天牛和黄斑星天牛全部聚于同一分枝中；星天牛、四川星天牛作为属内近缘种再与光肩星天牛和黄斑星天牛的分枝聚于一枝中，黄星天牛、松墨天牛作为属外近缘种单独聚于一分枝中，花曲柳窄吉丁作为外缘种单独成一分枝。

在光肩星天牛与黄斑星天牛群体分枝中，甘肃、河北、内蒙古、陕西的光肩星天牛样品及河北、甘肃的黄斑星天牛聚于一起；中国宁夏、安徽、浙江、湖北、山东的光肩星天牛样品及山西、宁夏黄斑星天牛样品聚于一分枝；美国芝加哥和纽约的光肩星天牛，以及韩国的光肩星天牛则分别聚于2个分枝中。

3 讨论

通过对24个不同地理来源的光肩星天牛及8个近缘种和1个外缘种的mtDNA COⅠ基因的序列(图 1)比较及PAUP*4.0 NJ系统树(图 2)的分析，发现该段基因的进化速率与上述研究的害虫种类的分类地位一致，也就是说该段基因适合于该类昆虫的遗传学研究及种类鉴定。

在系统树中，来自中国、美国和韩国的光肩星天牛可明显分为4个分枝，其分枝与地理来源有相对应的关系，本研究中的各地光肩星天牛(含黄斑星天牛)明显呈现出4个种群特征即：美国种群、韩国种群、中国北方种群和中国南方种群，但韩国的光肩星天牛与美国样品在作者的RAPD研究(安榆林等，2004)结果有差异, 因此光肩星天牛的种群区分尚需通过其他研究途径加以证实和补充。研究结果表明：美国的光肩星天牛与中国光肩星天牛存在较大的差异，研究结果不支持“美国的光肩星天牛是从中国传入的”。

从地理上看，宁夏、山西位于中国北部，但在本研究中，采自这两个省的光肩星天牛样品的mtDNA COⅠ基因片段与中国南方各省的光肩星天牛样品更为相似，系统树将其归为南方种群分枝中，原因可能与天牛的自然扩散和人为传播有关。从光肩星天牛发生区的总体情况来看，天牛发生的时间是东部早于西部，但危害程度却是从东到西逐渐加重(周嘉熹等，1980；熊善松，1995)，这是由于光肩星天牛危害面积大，虫口密度高，极易伴随苗木调运，货物运输或其他人为活动传播扩散，致使疫点和疫区从东到西不断增加和扩大(骆有庆等，1999)。因此，宁夏、山西的光肩星天牛样品很可能是由于上述原因而与南方种群混杂。

在NJ系统树中可以看到，所有中国黄斑星天牛和光肩星天牛样品均聚于同1分枝中。由此可以说明，黄斑星天牛与光肩星天牛实为同一种的不同生物型。多年来许多专家从形态学特征、寄主、食性及地理分布上将光肩星天牛和黄斑星天牛作为2个种(蒋书楠，1980；陈斌，1989；吴蔚文等, 1998；杨雪彦等，1995)。然而最近的研究表明，这2个种之间没有明显的生殖隔离，在中国的北方和西北部分地区共同存在，野外观察中发现它们可以自由交配并能产生不同类型的后代(高瑞桐等，2000)。近年来对其生物学特性的研究表明：光肩星天牛和黄斑星天牛很可能是同1个种(骆有庆等，2000)。

本研究认为光肩星天牛和黄斑星天牛为同1个种的不同生物型：

白斑型Anoplophora glabripennis(forma glabripennis Motschulsky)：鞘翅纯黑色；翅斑纯白色，较小，边缘较模糊；肩区刻点较大而明显，表面较粗糙，在肩角处尤为突出。

黄斑型Anoplophora glabripennis(forma nobilis Ganglbauer)：鞘翅黑色略带古铜色光泽；翅斑乳黄色至黄色，较大，边缘较清晰，第四横行斑大；肩区刻点较小而不明显，表面常具细皱纹。

四川星天牛和光肩星天牛形态上十分相似，四川星天牛分布于云、贵、川，以往经常将其误认为光肩星天牛。这两种差别在于光肩星天牛鞘翅漆黑色，基半部特别是肩角及其后方有密而较大的刻点，肩角顶端内突有小瘤突；而四川星天牛鞘翅表面具有很强的金属绿至青蓝色光泽，整个鞘翅光滑，难见刻点，鞘翅肩角顶端内侧光滑，无瘤突等。基因序列分析和聚类分析结果表明，采自中国重庆的四川星天牛和光肩星天牛差异很大，处于不同的分枝中。这一结果可认为四川星天牛是一个独立的种，这与许多专家根据形态学及生物学研究的结果一致(陈斌等，1989；吴蔚文等，1998)。