油杉(Keteleeria fortunei)属裸子植物亚门(Gymnospermae)松科(Pinaceae)油杉属，主要分布在我国广东、广西、福建、浙江南部沿海山地，生长于海拔800 m以下的阳坡或林缘，为我国特有树种，是古老的孑遗植物，对研究我国南方的植物区系有一定学术价值(郑万钧等，1978；林来官，1982；Fu et al., 1999)。油杉材质好，抗性强，树型美，可做为沿海山地的造林树种和造园树种, 是珍贵用材树种之一。根据笔者近年来的调查发现, 油杉多呈散生状态, 自然种群生长极为缓慢, 植株常发育不良，自然结籽率低，自我更新能力较差。据笔者对采样地油杉居群中成熟球果的观察，油杉球果的结籽率一般只有30%~50%。油杉已作为易危(VU)种，载入《中国植物红皮书》(傅立国，1992)和《广东省珍稀濒危植物图谱》(刘玉壶等，2000)。导致植物稀有濒危的重要内部因素有遗传力、生殖力、生活力、适应力的衰竭等，大多数珍稀濒危植物或多或少都存在生殖障碍。种子是有性生殖的产物。有性生殖过程中各个环节的障碍都可能导致种子败育。关于油杉的苗木繁育、结构解剖、核型等方面已有报道(吴文珊等，1993；朱积余等，1993；Lin et al., 2000)，但目前油杉的胚胎学研究尚属空白，为了从雄球花发育这个角度探究油杉自然结籽率低的原因及其生殖过程与物种濒危的关系，我们应用常规压片法和整体染色透明法对油杉小孢子的发生和雄配子体的发育过程进行了较详细的观察，并初步研究了其传粉生物学特征。

1 材料和方法 1.1 实验材料

取自福建省莆田市市郊广化寺旁一棵树龄约20年的油杉野生植株。根据多年的观察，此棵油杉每年能开出较多的小孢子叶球序，且从其树龄、发育状况、所处生境等看，此棵油杉较具代表性。采取定点、定株、定向、定时采集样品。根据前一年预观察，选择采样时间为2003年1月14日—2003年3月10日，每日上午1次，每次随机采20~30个小孢子叶球序，均取自树冠中部东南方向的枝条。仔细剥去外部包裹的鳞片, 迅速固定于卡诺液中，24 h后换至70%酒精，贮存于4 ℃冰箱中。部分材料不经固定用于花粉活力测定和花粉萌发实验。2003年3月1日—2003年3月6日兼采集大孢子叶球并在体视显微镜下解剖拍摄。采集观察以上述所提一棵油杉为主，居群中其他植株作辅助采集，以观察小孢子叶球发育的同步性。

1.2 实验方法 1.2.1 小孢子发生阶段

醋酸洋红染色压片法。

1.2.2 雄配子体发育阶段

整体染色透明法(杨弘远，1986；杨鹭生等，2004)。固定材料经1 mol HCl 60 ℃下水解10~12 min后，用爱氏苏木精染色液或醋酸洋红染色液室温下整体染色2~3 d，梯度酒精逐级脱水，最后以水杨酸甲酯透明，制成压片。以醋酸洋红染色压片法作为对照。

1.2.3 小孢子发生与雄配子体发育时期的确定

每次样品随机观察其中10个小孢子叶球序，每个小孢子叶球序随机取1个小孢子叶球，用醋酸洋红染色压片法分别观察其位于基部的小孢子囊发育时期，以制片的多数发育期确定为当日小孢子发生或雄配子体发育的时期。

1.2.4 TCC(2, 3, 5氯代三苯基四氮唑)染色法检验花粉活力(胡适宜，1993)

试验重复4次，每次观察5个以上视野的花粉。花粉生活力=红色的花粉粒数量/所观察的花粉粒总数×100%。

1.2.5 花粉粒萌发实验方法

花粉培养用A1(10%蔗糖+100 mg·L^-1硼酸+100 mg·L^-1氯化钙)和A2(10%蔗糖+100 mg·L^-1硼酸+100 mg·L ^-1氯化钙+100 mg·L^-1赤霉素)的液体培养基，25 ℃下悬滴培养，24 h后镜检，在10×10视野下统计其中的花粉粒总数与萌发的花粉粒数。试验重复4次，每次观察5个以上视野的花粉。花粉萌发率=萌发花粉数/花粉粒总数×100%。

所有制片均用OlympusBX51型显微镜进行观察并摄像。

2 实验结果 2.1 小孢子的发生

油杉雄球花(小孢子叶球序)外有棕色芽鳞保护，内簇生4~8个小孢子叶球。每一小孢子叶的远轴面基部着生2个小孢子囊。1月中旬, 每个小孢子囊内均已充满密集的多边形造孢细胞，(图版Ⅰ-1)。1月20日后, 原聚集在一起的造孢细胞开始离散，外形转变为圆形或椭圆形，核也增大，最终分化成为小孢子母细胞。1月26日, 它们的细胞壁薄，细胞质浓厚，积累大量淀粉粒，核及核仁变得很大，染色质丝明显可见, 开始进入减数分裂前期Ⅰ(图版Ⅰ-2)。分裂期中，核相变化与通常描述的一致(胡适宜, 1982)(图版Ⅰ-3~9)。在自然条件下, 油杉减数分裂期从开始至结束持续约11天，环境温度4~12 ℃。在减数分裂末期Ⅰ，两组染色体分别到达两极后，又聚集并逐渐解螺旋化，染色体变细长，但部分位置仍保持凝缩状态，核膜重现，形成两个子核，两个核之间不形成细胞壁, 出现一双核细胞(图版Ⅰ-7~8)。第1次减数分裂结束后，细胞处于短暂的不分裂状态，但染色体并不完全消失，随即进行第2次减数分裂, 两个核的分裂是同步进行的(图版Ⅰ-9), 四分体小孢子的壁同时形成, 为胞质分裂同时型。2月6日, 小孢子母细胞减数分裂结束, 形成四分体。油杉的四分体为左右对称, 也有四面体形，但左右对称型的占多数(图版Ⅰ-10)。气囊发育在四分体时期即开始(图版Ⅰ-10)。油杉的气囊是由花粉外壁外层和内层分开形成。2月9日后，四分体共同的胼胝质解体, 小孢子被释放出来形成单核花粉粒(图版Ⅰ-11)。减数分裂期间，小孢子叶球序稍肿胀，露出内层白色芽鳞，小孢子叶球仍被芽鳞包被，小孢子囊与小孢子叶的颜色区别明显，呈黄绿色。

笔者观察到小孢子发生的不同步现象。同一小孢子叶球中, 位于基部的小孢子叶较上部的发育较早，相差约3~4个分裂期。在同一个小孢子囊内, 小孢子母细胞的减数分裂基本同步或相差1~3分裂期, 如有的处于减数分裂Ⅰ后期, 有的则处于减数分裂Ⅱ后期(图版Ⅰ-22)。同一植株不同方向枝条上的雄球花发育阶段也出现参差不齐的现象，相差3~6个时期。另外，不同植株上雄球花发育水平存在明显的差异，如有的处于减数分裂Ⅰ时，有的已处于四分体时期。

2.2 雄配子体的发育

小孢子从四分体中释放出后约经18天的生长发育期，经4次连续有丝分裂形成五细胞结构的成熟花粉。从四分体中分散出来的小孢子是雄配子体的第1个细胞。刚释放出来的小孢子体积小，圆球形，细胞质稀，核居中，气囊小(图版Ⅰ-11)。随着发育的进行, 小孢子体积增大，气囊增大，气囊外壁呈网状加厚，细胞质稠，细胞核明显变大，染色深，随着细胞液泡化程度不断增加, 细胞核逐渐移向近极面(图版Ⅰ-12)，并很快进入第1次有丝分裂(图版Ⅰ-13)，2月17日已能看到第1原叶细胞和胚性细胞(图版Ⅰ-14)。第1原叶细胞呈凸透镜状，贴近壁的内侧，当胚性细胞进行1次不等的分裂形成第2个原叶细胞和精子器原始细胞时，第1原叶细胞即退化为线型结构(图版Ⅰ-15)。第2原叶细胞的形成和变化过程与第1原叶细胞相同，最终也变成线状结构(图版Ⅰ-16~21)。精子器原始细胞位于中央, 较大(图版Ⅰ-16)。精子器原始细胞再进行一次分裂(图版Ⅰ-17)，形成生殖细胞和管细胞(图版Ⅰ- 18)。最后, 生殖细胞进行1次分裂(图版Ⅰ-19)，形成精原细胞(体细胞)和不育细胞(柄细胞)。至2月28日，形成了包含2个原叶细胞、1个不育细胞、1个精原细胞和1个管细胞的5-细胞花粉(图版Ⅰ-20~21)。在成熟花粉中, 管细胞占据大部分面积，呈厚底浅口的杯状体，精原细胞(体细胞)和不育细胞(柄细胞)位于管细胞的杯口之中，精原细胞比管细胞小得多，圆形，处于与管细胞贴近的位置。不育细胞较精原细胞小，呈椭圆形至透镜形，紧贴着精原细胞，靠近花粉的近极端。

当单核小孢子开始有丝分裂时，包在小孢子叶球外的芽鳞张开，外露的小孢子叶球呈黄绿色。由于小孢子叶球下部发育较早，所以，下部显得肿胀，颜色更浅，偏黄白色。油杉小孢子及雄配子体发育进程见表 1。

2.3 异形花粉

油杉成熟花粉具2个气囊，气囊呈肾形，外有不规则网状饰纹。花粉全长112.7~126. 8 μm，体长81.1~88.2 μm，体高70.4~77.5 μm。在花粉发育过程中，产生具3、4个气囊的异形花粉(图版Ⅰ-23~24)，其比例约为0.02%。从染色结果看具3个气囊的花粉发育正常(图版Ⅰ-23)，具4个气囊的花粉发育不正常(图版Ⅰ-24)。4气囊花粉可能是花粉母细胞未经正常减数分裂所致，或是减数分裂Ⅱ后未能形成正常胼胝质壁将4个子核分割所致。

2.4 花粉活力与萌发率

通过TCC染色法测定，油杉成熟花粉的生活力平均值为92.6%，即有92.6%的花粉粒出现红色反应，表明油杉花粉的生活力较高。用高温杀死花粉后，没有花粉粒能与TCC产生红色反应。但花粉萌发试验结果表明，在A1和A2的液体培养基中，油杉花粉萌发率均不高，而在A1培养基中花粉萌发率平均为31.6%，在A2培养基中花粉萌发率平均为32.3%，两种培养基的培养结果并无显著差异，说明附加赤霉素并不能提高油杉花粉的萌发率。

2.5 传粉过程

油杉约于3月1日开始散粉。散粉时，雄球花呈开展状态，小孢子叶球轴已伸长，便于花粉散出。位于小孢子叶球下部的小孢子囊先破裂，黄色花粉撒出，随风传播，为风媒传粉。油杉的传粉约持续8天，起初花粉量少，3月3日至5日进入传粉盛期，具有明显的爆发性，3月6日后花粉量急剧减少。在传粉期间气温13~25 ℃，白天晴朗，干燥，有一定风力，3日与5日晚下小雨。油杉为雌雄同株植物，但70%的雄球花分布于植株的中下部，而雌球花主要分布于上部，这种分布规律可能可避免自花传粉。

油杉雄球花散粉期与雌球花的可授期是吻合的。在传粉期间，大孢子叶球直立，珠鳞间张开(图版Ⅰ-25)，很容易接受到花粉。取大孢子叶球解剖，胚珠珠孔端具耳状结构(图版Ⅰ-26~27)。在传粉期间，许多花粉已落在珠鳞的背面、小孢子叶球轴上，也有一些花粉被粘附在胚珠珠孔端耳状结构上(图版Ⅰ-28)。将带雌球花的枝条插于水杯中，分别于上午和下午各1次观察胚珠珠孔端耳状结构的变化，发现整个传粉期内珠孔端并无传粉滴形成。传粉期过后，珠鳞逐渐膨大，封闭了花粉进入胚珠的通道。

3 讨论

从小孢子的形成过程看，油杉于1月下旬完成从造孢细胞到花粉母细胞的转变，并很快进入减数分裂阶段，减数分裂期约持续11天，这期间并无休眠阶段。裸子植物小孢子母细胞经减数分裂形成四分体, 这一过程曹玉芳等(1995)归纳为3种类型：1)小孢子母细胞经冬季休眠后，在春季解除休眠进入减数分裂期，如欧洲赤松(Pinus sylvestris)、欧洲云杉(Picea abies)和白云杉(Picea glauca)；2)在休眠以前, 小孢子母细胞进行减数分裂形成成熟花粉粒，如落叶松(Larix gmelinii)、扁柏属(Cha maecyparis)和红豆杉属(Taxus)植物；3)减数分裂起始于休眠之前, 休眠期间停止，解除休眠以后才完成发育。如欧洲落叶松(Larix decidua)和花旗松(Pseudotsuga menziesii)小孢子母细胞是以双线期渡过休眠，而异叶铁杉(Tsuga heterophylla)和北美乔柏(Thuja plicata)是以粗线期渡过休眠。从小孢子母细胞的发育进程看来，油杉属于第1种类型。

减数分裂期中，核相的变化与通常描述的一致。小孢子母细胞减数分裂时，2核之间不产生壁，两个核直接进行第2次减数分裂，四分体的形成属于同时型(胡适宜, 1982)。

从油杉雄配子体的发育过程看，单核花粉粒在18天内连续进行4次有丝分裂过程，其生殖细胞在传粉之前分裂为精原细胞和不育细胞，形成5-细胞型的成熟花粉。成熟花粉具两个退化的原叶细胞、一个不育细胞(柄细胞、一个精原细胞(体细胞)和一个管细胞，属于油杉型花粉(曹玉芳等, 1995)。松杉类植物中成熟花粉属于油杉型的还有冷杉属(Abies)、雪松属(Cedrus)、落叶松属(Larix)、云杉属(Picea)、金钱松属(Pseudolarix)。而松科松属(Pinus)的成熟花粉则属于松型，成熟花粉粒内含有4个细胞，包括2个原叶细胞、l个生殖细胞和1个管细胞，如黑松(P. thunbergii)(肖德兴等, 1990)和油松(P. tabulaeformis)(中国科学院植物研究所形态细胞研究室比较形态组, 1978)，但松科银杉属(Cathaya)在3-细胞阶段传粉。

从四分体释放出来的小孢子在进入有丝分裂之前，细胞核经过规律性的变化，移至近极面，初步建立起由近极面到远极面的轴向极性，4次有丝分裂方向都与之平行，因而，小孢子的第1次有丝分裂、胚性细胞的分裂及其后的精子器原始细胞和生殖细胞的分裂都是严格的极性平周分裂，结果形成了极性排列的5-细胞花粉。从近极面至远极面，5个细胞分别是：第1原叶细胞、第2原叶细胞、不育细胞(柄细胞)、精原细胞(体细胞)和管细胞。这种来源于同一母细胞的一列细胞的分裂方式被认为是有限时间内的典型的有丝分裂类型(张仲鸣等，1999)。这种分裂的意义在于，最先形成的细胞与之后形成的细胞间的差异随着分裂次数的增加而增加，从而使它们间具有明显的极性并完成分化过程。产生极性是花粉发育中的普遍现象。小孢子细胞核的位移很可能是大多数植物小孢子不对称分裂的前提条件之一(吕世友等, 2001)。Twell(1999)在最近的综述文献中指出，细胞核的位移与纺锤体轴的决定均是保证小孢子正常不对称分裂的两个重要过程。众所周知, 细胞骨架对决定核位移和分裂面起重要作用；极性的建立还可能与细胞内蛋白质、RNA等物质的极性分布有关；同时，形成子细胞后各子细胞间由于无胞间连丝而被严格地控制着细胞间的信息交换，使已建立的极性得到强化并固定下来。从油杉雄配子体的形成过程可以看出，来源于同一母细胞的5个细胞在大小、形态、结构和命运等方面都有明显差异，说明极性强化的过程也是完成细胞分化的过程。

值得注意的是，花粉发育过程中2个原叶细胞的退化可能是一种细胞程序性死亡(programmed cell death, PCD)，但至今尚未见到有关研究的详细报道。PCD在植物体整个生长发育过程中普遍存在，雌配子体(胚囊)发育过程中，珠心组织被作为营养物质吸收而退化的过程、大孢子母细胞减数分裂后靠近珠孔端或靠近合点端的3个大孢子的退化和小孢子母细胞减数分裂过程中绒毡层细胞退化解体等都被认为符合PCD的基本特征(崔克明，2001)。细胞的程序性死亡是受一系列调控基因调控的, 崔克明(2001)认为，细胞程序死亡在植物体的整个发育过程中具有不可替代的重要意义，PCD在生殖器官的发育中保证了功能细胞的发育和生殖过程的完成，从而保证配子体的正常发育。可以推测，油杉雄配子体发育过程中2个原叶细胞的退化对雄配子体的正常发育具有重要意义。

从小孢子的发生及雄配子体发育的整个过程看，油杉从花粉母细胞形成至花粉成熟经历了34天，发育正常，并能形成大量正常的成熟花粉。通过TCC染色法测定表明, 油杉花粉的生活力较高。花粉发育中出现的具3、4个气囊的异形花粉属于个别现象。因此，花粉个体发育不是影响油杉结籽率低的主要因素。至于为什么油杉花粉萌发率均不高，笔者认为有两方面原因：一是所用培养基可能不适合油杉花粉萌发；二是油杉花粉可能存在某种生理性休眠机制。赤霉素对植物花粉的萌发和花粉管伸长具有促进作用(张绍铃等，2002；Swain SM et al.，2004)。但赤霉素不能打破油杉花粉休眠并促进其萌发。油杉花粉萌发的条件及其在自然条件下的萌发过程都有待进一步研究。

笔者初步认为，油杉球果结籽率的高低主要决定于其传粉过程。油杉属于风媒传粉，传粉受气候影响较大；而且油杉的传粉盛期仅有2~3天，具有明显的爆发性。可以想象，如果在传粉盛期风力小或下雨，那么将极大地减少雌球花的授粉率。据对传粉期末雌球花的解剖观察，1个雌球花中，胚珠珠孔端耳状结构上粘有花粉的概率大致为50%，与球果的结籽率相当。

值得说明的是，油杉大孢子叶球直立，胚珠倒生，胚珠珠孔端具耳状结构，整个传粉期内珠孔端并无传粉滴形成。笔者推测，油杉的传粉机制属于“花粉具气囊，胚珠倒生但无传粉滴”型(邢树平，2000)。但由于对雌球花授粉后的情况没有观察，所以油杉的传粉机制问题有待进一步研究。

油杉雄配子体发育过程中形成的胚性细胞、精子器原始细胞、管细胞中都具有淀粉粒，淀粉粒的存在影响对其有丝分裂中核相变化的观察，所以在制片过程中先用盐酸水解，尔后运用了整体染色透明法制片观察。整体染色透明法一般用于观察植物胚囊结构(杨弘远，1986；杨鹭生，2004)，整体染色透明法不需要切片，只经过染色后再用透明剂透明便可在显微镜下观察，操作过程简单，可获得富于立体感真实的观察效果。实验结果表明，整体染色透明法也是观察花粉个体发育的有效制片方法，特别适用于花粉粒较大的植物。

近20年来，我国植物胚胎学获得了突出的成果，在裸子植物特有属种的胚胎发育描述和为讨论系统位置提供胚胎学佐证方面的研究独具特色(Hu, 2002)。王伏雄等(1960)报道云南油杉(Keteleeria evelyniana)的初期胚胎发育过程，刘成运(1985)观察了云南油杉在受精过程中新细胞质及蛋白泡的发生和变化。本研究报道了油杉的小孢子形成、雄配子体发育及传粉情况，为系统分类提供有意义的胚胎学证据，同时可为制定有效的保护措施和提高林业生产提供重要的科学依据。