山茶属(Camellia)红山茶组(Section Camellia)植物花色艳丽，树型美观，可作园林观赏树种和盆景；同时，该组的许多种类是优良的油料树种，其油脂具有很高的营养价值；其花、叶的内含物可作工业和医药原料。因此，该组植物具有很高的环境、生态、经济和社会价值。前人根据植物的营养器官和生殖器官的形态特征对山茶属植物的分类进行了研究(张宏达，1981；张宏达等，1996；闵天禄，1992；1998；1999；闵天禄等，1996)，并利用RAPD技术研究了部分林木的遗传特性(叶创兴等，1997；刘平等，2005；刘建锋等，2004；甘四明等，2003；李周岐等，2002a；2002b；姜静等，2002；吴燕民等，1999；尤勇等，1998；苏晓华等，1997)。而利用RAPD技术对山茶属植物的研究不多见，仅有关于山茶属植物油茶组(Section Oleifera)与金花茶组(Sect. Chrysantha)的分子分类(谭晓风等，2005)、山茶属植物RAPD分析的DNA扩增的影响因素(唐绍清等，1998)及利用RAPD进行茶组(Sect. Thea)植物遗传多样性和分子系统学分析(陈亮等，2002)。对山茶属红山茶组植物的研究也比较少见。王雅琴等(1990)对长毛红山茶(C. villosa)和长尾红山茶(C. longicaudata)的核型进行了分析，杨志玲等(2004a；2004b)对山茶属红山茶组植物种间及部分物种与品种杂交的亲和性进行了研究，田晔林等(2004)对湖南省山茶属红山茶组植物资源及其观赏特性有过报道，而利用RAPD分析对山茶属红山茶组植物进行分类的研究尚未见报道。用传统分类方法对山茶属红山茶组植物分类时，其分歧较大(张宏达，1981；张宏达等，1996；闵天禄，1992；1998；闵天禄等，1996)。其原因主要是植物的形态指标易受地形、土壤、气候等环境因素的影响，有些物种在形态上原始性状和进化性状并存。为了解决这一问题，有必要对其基因组结构和组成进行研究，应用RAPD技术从DNA水平对其群体遗传关系进行分析，以提供山茶属红山茶组植物分类的辅助依据，弥补单纯以植物的形态为依据进行分类的不足，同时，为山茶属红山茶组植物种质资源的进一步保护和利用提供参考。

1 材料与方法 1.1 试验材料

试验材料为红山茶组中的29个种的叶片，其中，冬红山茶(C. hiemalis)取自日本琉球，其余的28个种取自中南林业科技大学山茶属种质资源库, 其名录见表 1。

1.2 试验方法 1.2.1 DNA的抽提

采用改良的CTAB法抽提红山茶组植物叶片中的DNA(谭晓风等，1999)。

1.2.2 DNA浓度的测定

采用Du-640核酸蛋白分析仪测定从叶片中抽提出的DNA浓度及纯度。

1.2.3 PCR扩增

PCR反应体系为：DNA模板3.0 μL(15 ng)，10倍缓冲液1.5 μL，25 mmol·L^-1 MgCl₂ 1.0 μL(缓冲液及MgCl₂购自华中农业大学遗传改良国家重点实验室)，25 mmol·L^-1 dNTPs 0.8 μL，10 μmol·L^-1引物1.2 μL，5 U Taq聚合酶0.2 μL，ddH₂O 7.3 μL，共计反应液15 μL。扩增程序为：94 ℃变性5 min；94 ℃变性1 min，35 ℃退火1 min，72 ℃延伸2 min，45个循环；72 ℃延伸7 min；然后终止反应，4 ℃条件下保存。

1.2.4 PCR结果检测

将扩增后的15 μL反应液注入1.4%的琼脂糖凝胶上的点样孔中，在0.5倍TBE缓冲液中电泳约2 h，电压为220 V，用溴化乙锭染色约15 min，水洗，在自动凝胶成像仪上检测结果。

1.2.5 引物的筛选

从购自美国OPERON公司的310种随机引物中筛选出23个多态性较多的随机引物对29种红山茶组植物进行RAPD分析。

1.2.6 数据记录与分析方法

观察不同物种利用各种引物扩增谱带上的差异情况, 每一个样品相对于某种引物的某一位点谱带，有带记为“1”，无带记为“0”，强带和弱带均记为“1”。利用0-1聚类软件计算，得到其相容关系和聚类图。多元样本的模糊聚类采用UPGMA法(Sneath et al., 1973)，利用AMHJL.BAS程序(钟扬等，1990)计算。匹配系数R_ij的计算公式为：

式中：M为变量个数(本文中相当于标记条带数)；k为样本数(本文中相当于山茶属植物种的个数)；X_ik为第i号样本第k个变量的观测值(本文中为样本DNA同一位点上扩增条带的有无，分别用1，0表示)。用相容关系R_ij描述2个样本i与j之间的模糊关系，全部R_ij组成的矩阵称相容关系矩阵。该公式只适用于全部X_ik为0，1型数据的情况，由程序可自动生成相容关系矩阵，再由此矩阵推出等价关系矩阵RR(即传递闭包)，然后由指定阈值(λ值)算出λ截集(即分类结果)，由小至大可以形成分类结果关系图。

2 结果与分析 2.1 DNA浓度及纯度分析结果

采用改良的CTAB法抽提叶片中的DNA，29种红山茶组植物叶片中DNA的得率为80~120 μg，纯度为1.4~1.9，可以满足RAPD分析要求。

2.2 引物的筛选

从购自OPERON公司的310种随机引物OPAA—OPAZ进行筛选，共选出23种对红山茶组植物扩增的有效引物(表 2)。

2.3 红山茶组植物的相关分析

利用筛选出的引物对山茶属红山茶组29个种的植物进行RAPD分析。扩增结果用0-1聚类软件计算，得到相容关系表(表 3)。由表 3可知，表示红山茶组植物亲缘关系的相容关系系数在0.360 5~0.965 1之间，其变化范围较大，这可能是由于红山茶组植物地理分布范围较广所致。

2.4 红山茶组植物的聚类分析

对山茶属红山茶组29个种的RAPD分析结果进行聚类分析，得到聚类图(图 1)。由图 1可知，当取λ为0.74时，可将29个种划分为4大类。其中厚叶红山茶、离蕊红山茶、尖萼红山茶、钱叶红山茶、全缘红山茶、冬红山茶、浙江红山茶、长尾红山茶、闪光红山茶可归为一类；绵管红山茶、大方红山茶、赫江红山茶、毛蕊红山茶、多齿红山茶、长柱红山茶、长毛红山茶可归为一类；秃苞红山茶、怒江红山茶、东安红山茶、腾冲红山茶、滇山茶、隐脉红山茶、西南红山茶、栓壳红山茶、毛籽红山茶、大花红山茶、溆浦大花红山茶、西南白山茶可归为一类；短管红山茶与其他28个种相容关系最小, 遗传距离最大，亲缘关系最远，可将它单独聚为一类。

由图 1还可知，秃苞红山茶与怒江红山茶的相容关系系数为0.965 1，其亲缘关系最为接近；此外，多齿红山茶、长柱红山茶与长毛红山茶之间的相容关系系数在0.9以上，其亲缘关系也非常接近；冬红山茶、全缘红山茶与浙江红山茶之间的相容关系系数也在0.9以上，其相似程度非常高。

3 结论与讨论

关于山茶属植物的分类，主要存在张宏达分类系统和闵天禄分类系统2种观点。张宏达(1981)将山茶属植物分为4个亚属20个组：1)原始山茶亚属(Subgen.Protocamellia Chang), 它包括古茶组(Sect. Archecamellia Sealy)、实果茶组(Sect. Stereocarpus Sealy)以及匹克茶组(Sect. Piquetia Sealy)；2)山茶亚属(Subgen. Camellia)，它包括油茶组(Sect. Oleifera Chang)、糙果茶组(Sect. Furfuracea Chang)、短柱茶组(Sect. Parcamellia Sealy)、半宿萼茶组(Sect. Pseudocamellia Sealy)、瘤果茶组(Sect. Tuberculata Chang)以及红山茶组(Sect. Camellia)；3)茶亚属〔Subgen. Thea(L.) Chang〕，它包括离蕊茶组(Sect. Corallina Sealy)、短蕊茶组(Sect. Brachyandra Chang)、长柄茶组(Sect. Longipetiolata Chang)、金花茶组(Sect. Chrysantha Chang)、茶组〔Sect. Thea(L.) Dyer〕、超长柄茶组(Sect. Longissima Chang)以及秃茶组(Sect. Glaberrima Chang)；4)后生茶亚属(Subgen. Metacamellia Chang)，它包括连蕊茶组(Sect. Theopsis Coh. St.)、毛蕊茶组(Sect. Camelliopsis Sealy)以及管蕊茶组〔Sect. Calpandria(Bl.) Coh. St.〕。闵天禄(1992；1996；1998；1999)则认为金花茶组不具备分组条件，将其并入古茶组；将长柄茶组和超长柄茶组合并，称为长梗茶组(Sect. Longissima Chang)；将小黄花茶组(Sect. Luteoflora Chang)并入实果茶组；将秃茶组并入茶组；将短蕊茶组并入离蕊茶组；将短柱茶组并入油茶组；另立柱蕊茶组(Sect. Cylindria Ming)；共分为14组，分属于茶亚属和山茶亚属；同时，将红山茶组撤消，将其中的大部分种归入山茶亚组中。根据谭晓风等(2005)对油茶组、金花茶组及本研究中对红山茶组的RAPD分析以及张宏达(1981)的研究结果，作者认为将红山茶组单独分类是合适的。

本文中，对红山茶组植物中的29个种进行聚类分析，将其分为4类，此结果与张宏达(1981)以形态指标为依据对红山茶组的分类结果基本上是一致的。本研究结果中，将厚叶红山茶、离蕊红山茶、尖萼红山茶、钱叶红山茶、全缘红山茶、冬红山茶、浙江红山茶、长尾红山茶、闪光红山茶归为一类，与张宏达(1981)分类系统中光果红山茶亚组(Subsect. Luci dissima Chang)的分类结果一致；将绵管红山茶、大方红山茶、赫江红山茶、毛蕊红山茶、多齿红山茶、长柱红山茶、长毛红山茶归为一类，与张宏达(1981)分类系统中毛蕊系(Series Chrysanthae Chang)的分类结果一致；将秃苞红山茶、怒江红山茶、东安红山茶、腾冲红山茶、滇山茶、隐脉红山茶、西南红山茶、栓壳红山茶、毛籽红山茶、大花红山茶、溆浦大花红山茶、西南白山茶归为一类，与张宏达(1981)分类系统中滇山茶系(Series Reticulata Chang)的分类结果一致，滇山茶系与毛蕊系同属于滇山茶亚组(Subsect. Reticulata Chang)。与张宏达(1981)分类系统所不同的是，短管红山茶与其他28个种之间的相容关系最小，遗传距离最大，亲缘关系最远，将它单独聚为一类，而在张宏达的分类系统中，将其归入光果红山茶亚组。短管红山茶的归属问题有待进一步研究。

总的来讲，本研究的RAPD分析结果基本上支持张宏达的山茶属红山茶组植物分类方法，说明形态上的相似性与DNA的相似性有很强的相关性，进一步从DNA水平为张宏达的分类结果提供了较为有力的证据。

冬红山茶(C. hiemalis)产于日本，本次试验结果表明，它与浙江红山茶亲缘关系较近，可并入第一类，即张宏达(1981)分类系统中的光果红山茶亚组。

应用RAPD技术从分子生物学角度对红山茶组植物的亲缘关系进行分析发现，红山茶组内具有亲缘关系较近的种，如秃苞红山茶(C. glabriperulata)与怒江红山茶(C. saluenensis)之间，多齿红山茶(C. polyodonta)、长柱红山茶(C. longisttyla)与长毛红山茶(C. villosa)之间，冬红山茶(C. hiemalis)、全缘红山茶(C. subintegra)与浙江红山茶(C. chekiangoleosa)之间的亲缘关系都十分接近。对其亲缘关系进行分析将为红山茶组植物的分类、红山茶组植物起源与演化的研究以及新品种的培育提供非常有价值的资料。