植物苯丙烷类代谢途径是植物体内次生物质代谢的一条重要途径，由于该途径可形成包括植保素、木质素和酚类化合物等在内的抗病次生物质(薛应龙等，1999)，使之成为植物抗病反应中重要的代谢途径之一。苯丙烷类代谢在植物抗病反应中的作用主要归功于该途径积累的抗病物质对病原物的毒性。然而，由病原物侵染诱导合成并积累的许多苯丙烷类代谢产物通常在毒害病原物的同时，也对寄主细胞有毒(海蒂弗斯等，1991)。酚类物质在过氧化物酶(POD)和多酚氧化酶(PPO)的作用下氧化形成的褐色或黑色化合物是引起组织细胞褐变的原因，而酚类物质的氧化总是与植物细胞的解体相联系(Siriphanichd et al., 1985；鞠志国等，1988)。因此，在某些植物病害中，病原物通过影响寄主植物的苯丙烷代谢途径，导致某些直接或间接代谢产物的不断积累，造成寄主植物的代谢紊乱或细胞自毒是感病植株死亡的原因。

松材线虫病是由松材线虫引起的一种毁灭性森林病害，发病迅速，死亡率极高。松材线虫病的组织病理学研究表明，松树受松材线虫侵染后，首先表现为木质部薄壁细胞的变性坏死，且这种细胞坏死随线虫侵入时间的延长而加剧，当症状出现时，皮层、韧皮部和木质部薄壁细胞的死亡已相当普遍，组织细胞不断的褐变坏死是松材线虫病的特征之一(Mamiya，1985；Kusunoki，1987；刘军明等，1995)。Oku等(1979)和Shaheen等(1984)分别从感病植株中分离到几种有毒物质，其中以苯丙烷代谢的中间产物苯甲酸(BA)引起的症状与松材线虫接种后引起的症状最为相似(Oku et al., 1990)，但目前国内外少见关于松材线虫侵染对寄主苯丙烷代谢途径影响的报道。笔者采用1.5年生盆栽马尾松幼苗为研究材料，探讨了苯丙烷类代谢途径中的苄丙氨酸解氨酶(PAL)以及与该途径密切相关的POD、PPO活性和总酚含量在病程中的动态变化，旨在了解这些变化在松材线虫病害发展中的作用及与病害发生发展的内在联系，为进一步研究松材线虫病发病机理提供依据。

1 材料与方法 1.1 供试松材线虫及松幼苗 1.1.1 松材线虫的来源和培养

从江苏林科院苗圃中自然条件下感病的20年生黑松(Pinus thunbergii)主干距地面1.5 m处采样。经贝曼分离技术(baermann funnel technique)分离松材线虫(方中达，1998)，消毒处理后，于灰葡萄孢(Botrytis cinerea)菌落上25 ℃下培养6~7 d后，备用。

1.1.2 松幼苗的培养

马尾松(P. massoniana)实生苗(1.5年生)购自当地苗圃，于培养室内适应生长1个月后待用。

1.2 接种方法

选取生长基本一致，平均苗高40 cm，直径(茎中段)1.5 cm左右的马尾松幼苗，在距基部约10 cm的茎一侧采用皮接法接种松材线虫(即用锋利的小刀切开一约0.5 cm的伤口，伤口深达木质部，撕开韧皮部，在伤口处夹入一脱脂棉球，滴入线虫悬浮液，接种量约为每株1 500条，以线虫洗涤液做对照，然后用透明胶布封住伤口)。接种后，在相同条件下生长并定期取样分析。

1.3 取样及酚含量和酶活性测定方法 1.3.1 取样方法

接种后每隔2~3 d取生长基本一致的当年生针叶和距接种点约5 cm以上的茎段做分析样品(酚含量仅取茎测定)，各设3个重复，每个重复取3株苗，各重复间取样部位基本保持一致。

1.3.2 酚含量和酶活性的测定方法

采用《生物化学实验原理和方法》(李建武，1991)中的Bradford法测定可溶性蛋白质含量；4-氨基安替比林比色法测定(Koppe et al., 1979)酚含量，用邻苯二酚作标准曲线；参照樊自红等(1989)的方法测定PAL(苯丙氨酸解氨酶)活性；参照中国科学院上海植物生物研究所等(1999)的方法测定PPO活性；参照李靖等(1991)的方法测定P OD活性。PAL以每小时每毫克蛋白的OD值变化0.1为一个酶活力单位；POD和PPO均以每分钟每毫克蛋白质的OD值变化0.01为一个酶活力单位。

2 结果与分析 2.1 马尾松苗对松材线虫侵染的反应

马尾松苗接种松材线虫后一般于接种后的第9~12 d出现典型的外部症状，多数于第15~18 d整株枯萎死亡，发病速度较快。接种苗发病时，部分针叶基部褪绿变色成红褐色或褐色，叶略下垂，失去光泽，着生病叶的茎段失水，皮层和髓褐变，随后病害向前扩展，褐变针叶数量增加，病变范围扩大。褐变沿针叶基部向叶尖蔓延，同时伴随失水，最后针叶萎蔫、褪绿，整株枯死。针叶初显病症时，其茎通常已严重失水枯萎，髓和皮层完全褐变，茎部发病早于针叶。

2.2 接种松材线虫对马尾松苗苯丙氨酸解氨酶活性的影响

马尾松苗接种松材线虫后，体内PAL活性呈现明显的动态变化且茎和叶中PAL活性在病程中的动态变化存在一定差异(见图 1A、B)。接种早期茎部诱导PAL活性变化较小，接种后第6天明显升高，第8天(症状出现前夕)接近活性高峰，其病/健比值为1.529；当病害症状开始出现时，酶活性下降，但仍高于对照值，其病/健比值为1.255。叶部则基本表现为随时间的进程逐渐上升的趋势，且后期比初期上升的幅度大，接种至第10天时酶活性最高，病/健比值达1.530，而在接种第2天的病/健比值仅为1.089，松材线虫侵染诱导叶部酶活性高峰的出现晚于茎部，但与叶片病变的速度一致。

2.3 接种松材线虫对PPO和POD活性的影响

马尾松幼苗接种松材线虫后，其茎、叶中的POD和PPO活性在病程中均表现出规律性的动态变化，但茎和叶之间存在差异(图 2A、B，图 2A、3A、图 2A、B)。图 2A表明，随时间的延长茎内POD活性明显增加，且一直呈上升趋势。接种时间越长活性上升的越显著，接种第4天时，POD活性平均仅比对照升高15.5%，但到第6天时便迅速增加到96.9%，至发病时(接种后8~10 d)POD活性平均比对照升高240.2%，发病后酶活性迅速下降。叶内POD活性的变化迟于茎，在叶片出现症状前其变化不大，但当症状出现时或出现前夕POD活性明显升高并随着叶部症状的不断发展而继续升高，表现出与叶部症状发展的高度一致性。显然，受侵植株POD活性的升高与症状发展有关。

图 3A表明，接种松材线虫后，松苗内的PPO活性从接种后第2天至发病前逐渐升高(接种后9~10 d发病)，比对照增高37.67%~64.51%，发病后明显降低。叶部酶活性在整个病程中也有所增加，但增加的幅度小于茎部，最大峰值仅比对照高28.06%，以上结果表明，PPO和POD两种氧化酶可能参与了松材线虫病的病害发展过程，并在其中起着重要的作用。

2.4 接种松材线虫对寄主植物总酚含量的影响

马尾松苗接种松材线虫后，随着侵染时间的延长酚类物质逐渐积累，至发病时(接种第11天)酚类物质平均比对照升高142.61%，发病后(接种第13天后)其酚类物质含量迅速降低，发病后2~3 d酚平均含量降至2.199 mg·g^-1FW，仅比对照高19.64%(图 4)。该结果表明酚含量的变化与病害发展及PAL、POD、PPO酶活性的变化基本趋于一致，松材线虫侵染引起的酚类物质合成量的增加与苯丙烷代谢速度加快有关。而在整个病程中，酚类物质的积累与病害的发展密切相关。

3 结论与讨论

松材线虫的侵染明显影响寄主植物的苯丙烷类代谢途径，随着侵染时间的延长，苯丙烷类代谢途径的关键酶和限速酶PAL活性逐渐升高，尽管在发病后酶活性逐渐下降，但在整个病程中PAL活性都高于对照。PAL活性的升高会引起由其所控制的某些次生代谢产物的积累，造成一定程度的代谢紊乱或细胞伤害。因此，在松材线虫与寄主互作过程中由松材线虫诱导的PAL活性变化对松材线虫病的发生发展可能起着非常重要的作用。

POD和PPO是苯丙烷代谢途径中2个重要的氧化酶，在酚类物质的合成和氧化中起着重要的作用。前人的研究表明，PPO和POD活性在寄主与病原物非亲和组合中常较亲和组合中上升得快且会高数倍。由于PPO和POD活性的增加常与有病植株中酚类物质的氧化联系在一起，且寄主的抗病性部分归功于这些氧化产物的毒性。因此，在多个病害系统中，2种氧化酶活性的增加与寄主植物的抗病性相关(海蒂弗斯等，1991)。然而，也有一些相反的报道(陈璋，1993；郭兴启等，1997)。另一方面，酚类物质及其氧化产物在毒害病原物的同时，对被侵寄主的细胞也是有毒的，酚类的氧化总是与植物细胞的解体相联系，而组织细胞的褐变通常也是酚类物质氧化的结果(海蒂弗斯等，1991；Siriphanichd et al., 1985；鞠志国等，1988)。很明显，PPO和POD在寄主和病原物互作中的活化不一定总与不亲和反应相并发生，也并不总是和寄主的抗病性相联系。赵羹梅等(1996)在研究POD活性与玉米自交系对丝黑穗病(Sphacelotheca reiliana)抗性的关系中发现，POD活性与发病率和组织透性增加呈极显著正相关，认为POD活性的提高也是受到伤害的一种表现。而郝玉金等(1999)的研究发现，山丁子(Malus baccata)感染毛刺线虫(Trichodorus nanjingensis)后，在整个病程中POD和PPO活性均高于对照，且早期比后期升高的幅度大，认为POD和PPO参与了根尖组织的坏死反应。因此，受侵寄主中PPO和POD活性的增加在植物抗感病中的作用，可能取决于特定病害系统中寄主和病原物的遗传及其生理生化特征。松材线虫侵染后引起的POD和PPO活性变化是否在病害发展和组织细胞坏死中发挥重要作用值得进一步深入探讨。

植株被松材线虫感染后，随着线虫侵入时间的延长，寄主植物内酚含量不断上升，但发病后迅速下降。由于在有氧条件下，酚类物质由PPO催化氧化为醌，醌再通过聚合作用产生有色物质引起组织褐变(Siriphanichd et al., 1985；海蒂弗斯等，1991)，而组织细胞褐变坏死是松材线虫病的重要特征(Mamiya，1985；Kusunoki，1987；刘军明等，1994)。因此，松材线虫诱导酚类物质的积累可能参与了寄主的病害发展和细胞褐变坏死过程。由松材线虫侵染引起的酚类物质的积累量对线虫和寄主细胞的毒害值得作一步的研究，它将有助于对松材线虫病机理的深入了解和致病因子的确定。