竹类植物主要分布在发展中国家，受资金、技术等因素制约，组培研究起步较晚。国外始于20世纪60年代(Alexander et al., 1968; Tseng et al., 1975); 80年代，进入系统研究阶段，主要通过诱导愈伤组织分化丛芽或胚状体获取再生小植株，或由愈伤组织进行细胞悬浮培养、原生质体培养(Huang et al., 1983; 1988;1989a;1989b;1990; Mehta et al., 1982; Rao et al., 1985; 1986;Yeh et al., 1986a; 1986b;1987; Hassan et al., 1987); 90年代，竹子组培研究进入了更深一层，主要通过以芽繁芽方式获得再生小植株(Tsay et al., 1990; Saxena, 1990; 1993;Chambers, 1991; Prutpongse et al., 1992; Rout et al., 1994; Chang, 1995; Ramanayake, 1997; Lin et al., 1998; Anil et al., 2002)，在组培条件下诱导外植体开花、结实(Nadgauda et al., 1990;1993; 1997; John et al., 1993; 1995)。我国竹类植物组培研究起步更晚，始于20世纪90年代，现已有多篇报道(张光楚，2000; 张光楚等, 1993; 1998;2001;2003;2004;吴益民等，2000; 马艳梅等, 1993; 王光萍等, 2002; 张铁等, 2004)。

巨龙竹(Dendrocalamus sinicus)是世界上秆形最大的工业用材竹种，其秆高可达30 m，直径20~30 cm，具有重要经济价值和广阔开发前景。其自然分布区狭窄、资源量较少，大量试验研究表明采用传统育苗法十分困难，组织培养可解决种苗迫切需求，目前尚无系统研究的文献报道(辉朝茂等, 1999; 2002;2003)。

1 材料与方法 1.1 试验材料及消毒处理

以种胚和成年竹茎段为外植体，在云南西盟县采集饱满、污染较轻的种子，共163粒。用2%~2.5%的NaClO溶液消毒15 min，蒸馏水清洗3次，催芽12~16 h。接种前，用0.2% HgCl₂溶液消毒30 min，清洗5次。

成年竹茎段分别采自新平、沧源以及西南林学院大棚(引自西盟县)，当年萌芽嫩枝与2年生枝条作对比试验。用75%的酒精擦洗2~3次，4 ℃下保存12~24 h，接种前用2% ~2.5%的NaClO溶液与0.2% HgCl₂溶液各消毒15 min与20 min。

1.2 试验方法 1.2.1 种胚的离体培养

1) 培养基及培养条件：采用改良MS、3/4MS和1/2MS作基本培养基，加入不同浓度的细胞分裂素(BA、KT)或生长素(NAA、IBA)及椰乳(CW)，外加蔗糖20 g·L^-1，琼脂粉6.4 g·L^-1。pH值5.8~6.2，温度(25±4)℃，每天辅助光照12 h，光照强度1 600~2 000 lx。2)无性系增殖培养：种子消毒后接种于MS+BA 0.5 mg·L^-1培养基上，萌芽至4 cm高时(15~25 d)转接到3/4MS+BA 2.0 mg·L^-1+KT 0.5 mg·L^-1+CW 100 ml·L^-1培养基中诱导丛芽，根据褐化情况进行继代培养，并大量淘汰萌芽慢、生长慢、无法诱导丛芽的无性系。选取增殖芽较正常的无性系进行正交试验，探讨MS、BA、KT、CW用量对苗生长、增殖作用(表 1)，并重复试验，筛选最佳增殖培养基。所有正交试验进行3次以上重复，每次供试芽丛不低于30个。3)无性系生根培养：1/2MS培养基，外加生长素NAA和IBA，正交设计试验，筛选最佳生根培养基(表 2)。4)再生小植株炼苗移栽：组培苗根半木质化时，旋松瓶盖，自然散射光下炼苗5~7 d，洗去培养基，植入多种配比的基质中; 与苏麻竹(D. brandisii)作对照，筛选较佳的炼苗基质。

1.2.2 成年竹茎段培养

采用1/2MS+BA 3~5 mg·L^-1+KT 0.8~1.2 mg·L^-1+CW 150 mL·L^-1 +蔗糖3%培养基，进行成年竹茎段试管引入、丛芽诱导，探索成年竹组织培养材料采集时间、部位、地点对诱导的影响，并根据丛芽诱导与增殖情况调整各生长调节剂的配比，5~15 d继代一次。

2 结果与分析 2.1 种胚的离体培养 2.1.1 试管引入结果及生长情况

163粒种子，4粒污染，7粒未萌芽，无菌种苗得率高达93.25%。继代5~7次后，获得63个能增殖的无性系。

2.1.2 无性系增殖及生根培养基筛选

选取增殖倍数较大的23号与增殖倍数适中的49号无性系进行丛芽增殖及生根培养基筛选试验，方案设计、统计与分析参照相关资料(毕庆雨, 1990; 庄楚强等, 2002)。

为获得增殖倍数适中、增殖芽高、生长良好的丛芽，进行了正交试验(表 1)。从表 1可看出，对增殖倍数影响顺序为BA＞MS＞KT＞CW，BA的极差最大，经F检验达到0.1水平，表明它在丛芽增殖诱导中起主导作用，各因素水平的最佳组合为：3/4MS+BA 2.5 mg·L^-1+CW 100 mL·L^-1; 对增殖芽高度影响顺序为KT＞CW＞BA＞MS，KT的极差最大，经F检验达0.1水平，在丛芽高生长方面起主导作用，各因素水平的最佳组合为：3/4MS+BA 0.1 mg·L^-1+KT 0.6 mg·L ^-1+CW 100 mL·L^-1。BA的用量与丛芽增殖倍数成正比，与丛芽高生长成反比; KT对增殖倍数的影响在0~0.3 mg·L^-1用量范围内成反比关系，在0.3~0.6 mg ·L ^-1用量范围内成正比关系，为提高增殖倍数和丛芽高生长，理论上可加大KT用量，但经长期大量试验发现：随着KT用量增加，丛芽生长加快、节间增长，形成畸形芽。BA用量达2.5 mg·L^-1时也产生较多畸形芽，且随着继代次数增多，丛芽逐渐矮化，形成花芽，说明BA使丛芽细胞从营养状态向生殖状态转化。逐渐降低BA用量到1.5 mg·L^-1，获得增殖倍数为5.23倍，生长良好、性状正常的苗，丛芽高度为4.09 cm，最佳培养基为：3 /4MS+BA 1.5 mg·L^-1+KT 0.5 mg·L^-1+CW 100 mL·L^-1。另外，长期在高浓度BA上培养产生花芽的苗，加大KT用量，可分化出正常的丛芽，即：KT有使细胞从生殖状态向营养状态转化的作用。

无性系增殖到一定数量后进行生根，培养基如表 2。从表 2可看出：4个因素对苗的生根、生长、成活的作用为IBA > KT > CW > NAA，IBA起主导作用，经F检验达到0.1水平。加大IBA、CW、NAA用量，4个指标逐渐变优; 在0~0.005 mg·L^-1内加大KT用量，对4个指标产生优化作用，在0.005~0.010 mg·L^-1内加大KT用量，对4指标产生抑制作用。综合分析得最佳培养基为：1/2 MS+IBA 6.0 mg·L^-1+NAA 2.0 mg·L^-1+KT 0.005 mg·L ^-1+CW 100 mL·L^-1。继而加大IBA、CW、NAA用量，4指标无明显增强。长期使用以上配方生根，4指标表现出较稳定的优良性。另外，对IBA与NAA作专门试验，发现加大NAA用量，每丛苗生根数量增多，根细长; NAA用量大于或等于4.0 mg·L^-1时，丛芽基部膨大形成愈伤组织，从愈伤组织上产生多条根，再生植株根系发达而茎叶枯黄，炼苗成活率低; 仅用NAA且用量大于或等于7.0 mg·L^-1时，再生植株只长根，地上部分枯死; 仅用IBA且用量大于或等于7.0 mg·L^-1时，每丛再生植株生根条数少(1~3条)，根短、粗、壮，炼苗也难成活，故适量IBA与NAA配合使用有利于丛芽生根和再生植株炼苗成活。

2.1.3 再生植株炼苗

23号无性系与苏麻竹组培苗进行对比炼苗，采用6种基质(体积比)炼苗：1)100%河砂; 2) 100%珍珠岩; 3)100%蛭石; 4)河砂+珍珠岩(1:1);5)河砂+蛭石(1:1);6)河砂+腐质土(1:1)。每组基质栽种生长情况相同的根半木质化(生根培养基上培养40 d)的小苗50丛。炼苗40 d后，结果为：23号成活率分别为50%、35%、23%、38%、29%、55%;苏麻竹为97%、89%、84%、93%、91%、98%。

从结果看：苏麻竹炼苗比巨龙竹容易，2种苗在有河砂的基质上炼苗成活率较高，在有腐质土的基质上成活率更高，生长更绿、更高、更快，发笋数更多，根系更发达，说明基质6)相对较优，但总体成活率偏低。

为了提高炼苗成活率，采用了多种措施，如：添加多种基质配比(河砂与腐质土以体积比1:1为上层、珍珠岩垫底)对照、改变小植株在培养瓶内的培养时间、水培炼苗、尽可能提高相对温湿度、加强管护等，成活率仍较低。经观察，发现小植株生根数越多，成活率越低，根系从丛芽基部膨大、似愈伤组织物上分化而来，对丛芽生根培养基作多次试验，发现高浓度NAA使丛芽生根前先产生愈伤组织再分化出较多细弱的根，降低NAA用量到2 mg· L^-1，并延长小植株在生根培养基上的生长时间(50~60 d)，成活率可提高到70%~90%。所有无性系在河砂与腐质土以体积比1:1为上层、珍珠岩垫底的基质上成活率最高，小苗生长最健壮。在长期炼苗试验中，发现在昆明5—8月份是最佳的炼苗时期。

2.2 成年竹茎段培养试验 2.2.1 材料最佳采集时间

2002年9、10、11月和2003年3月进行了4次巨龙竹成年竹枝条试管引入试验，每次接种60段。发现成年竹枝条试管引入无污染活体数越来越难获得，丛芽诱导也越来越困难; 2003年5、6、7、8月所引入材料无菌活体得率高达70%以上，丛芽诱导率达60%以上，说明材料在5—8月采集最佳。

2.2.2 材料最佳部位选取

2003年5月引入60段枝条，较老的、较嫩的和居中的分开消毒，考虑到NaClO药性较烈，HgCl₂相对温和些，故嫩枝条采用2次HgCl₂消毒。消毒情况如表 3。从表 3可看出：枝条过嫩容易受药害，过老难诱导丛芽，且小枝上通常稍部节尚未分化出芽点; 以枝条为外植体诱导丛芽，目的是诱导节上芽点萌芽并产生丛芽。一般半木质化枝上第1、2个节上未分化出芽点，第3个节上开始有芽，但消毒极易受药害而难于诱导成功，且诱导出的丛芽细小，生长不良，多次继代后变黄枯死。过老的节上芽点长期不萌动，极易褐化枯死。只有枝上第4、5个节芽较易诱导萌发，获得无菌材料，并进一步诱导产生丛芽。

2.2.3 不同采集地材料诱导情况

巨龙竹成年竹无菌活体，在1/2MS+BA 3~5 mg·L^-1+KT 0.8~1.2 mg·L ^-1+CW 150 mL·L^-1+蔗糖3%的培养基上多次继代培养后，发现不同时期、不同地点采集的材料对BA、KT用量产生不同结果。采用相同培养基分别对采自新平、沧源以及西南林学院大棚(引自西盟县)的材料进行培养，发现新平枝条BA用量在4 mg·L^-1以上，KT在1.0~1.5 mg·L^-1时可诱导丛芽; 沧源枝条BA在2~3 mg·L^-1，KT 0.8~1.0 mg·L^-1时产生丛芽; 大棚里的枝条BA 3. 0~3.5 mg·L^-1，KT 1.0~1.2 mg·L^-1，经继代6~8次产生丛芽。前二者需10~12次继代后才产生细弱丛芽，易褐化，需5~7 d继代一次，生长差，增殖倍数在1.15~1.21。后者10~15 d转移一次，丛芽生长健壮，增殖倍数在1.6~2.5，相对种胚，增殖倍数较低。

2.2.4 成年竹丛芽增殖、生根试验

成年竹诱导丛芽后，因产生大量无效苗，而逐渐降低激素用量，当降到BA 2.0 mg·L ^-1+KT 0.8 mg·L^-1时，丛芽增殖倍数、苗生长量显著降低; 对培养基作正交试验，其结果如表 4。从表 4可看出，4因素中，对丛芽增殖倍数影响最大的是BA，BA的极差最大，经 F检验达到0.1水平，表明它在成年竹丛芽诱导增殖阶段起主导作用; 其次是CW，经F检验也达到了0.1水平，4因素作用为BA>CW>KT>MS，各因素水平的最佳组合为：3/4MS+CW 150 mL·L^-1+BA 2.5 mg·L^-1+KT 1.0 mg·L^-1; 4因素中，对丛芽高生长影响为KT>CW>BA>MS，KT的极差最大，经 F检验达0.1水平，为主导因素，其次是CW，各因素水平的最佳组合为：1/2MS+CW150 mL·L^-1+BA 2.0 mg·L^-1+KT 1.0 mg·L^-1。经分析，既适宜提高增殖倍数又利于高生长的最佳培养基为：2/3MS+CW 150 mL·L^-1+BA 2.2 mg·L^-1+KT 1.0 mg·L^-1。

采用不同培养基进行多次生根试验，生根率均较低，生根后死苗现象严重。目前尚未达到较好效果。

3 结论与讨论

通过对巨龙竹幼年竹、成年竹组织培养研究，发现成年竹组培比幼年竹困难，这与张光楚等对麻竹、苏麻竹、杂种撑麻7号竹(Bambusa pervariabilis×Dendrocalamus latiflorus No.7)的研究结果相同(张光楚等, 1993; 2003;2004)，难诱导产生丛芽; 丛芽增殖倍数低，难生根; 易褐化、死苗，这是竹类植物进行优质种源快繁难以解决的大问题，有待从基因角度进一步研究。巨龙竹种胚离体培养很成功，组培苗在圃地生长良好，但巨龙竹是世界上秆形最大的竹子，来源于种胚的无性系是否保持母本优良性状，需进行优良无性系的选择(另文报道)。竹子开花、结实少见，巨龙竹开花、结实更难见，通常整丛开花，产生自花传粉，后代生活力和适应性下降，遗传品性单一(Saxena, 1990)，传统优良无性系筛选方法时间长、经费高、效率低，若能引入生化或分子水平检验(卓仁英, 2003)，可克服以上不足。

竹类植物组培较一般植物困难，接种时间长，成本高，随着继代次数增多，无性系增殖倍数逐渐降低; 丛芽易老化、褐化、黄化。传统分株育苗成本相对较低，无需激素刺激，对小苗的长期分化无较大影响，故可进行实验室组培快繁、田间分株并进，提高育苗效率，降低成本。

根据细胞分裂素BA有促进试管苗开花的作用，可考虑人工促进巨龙竹开花及人工授粉，获取遗传品性较好的种子，用于直接离体培养。

巨龙竹受水热条件限制，分布区狭窄。若能导入抗寒基因，可扩大其适应范围，有利于推广利用。另外，还可进行细胞和原生质体的培养、体细胞杂交、遗传诱导转化及其他的转基因操作，来获取性状更优的突变体或新品种，以便将植物生物技术应用到竹亚科(Bambusoideae)植物中(邢新婷等, 2003; 田波等, 2005)，研究提高竹类植物的利用价值。