文章信息
- 曹帮华, 蔡春菊.
- Cao Banghua, Cai Chunju.
- 银杏种子后熟生理与内源激素变化的研究
- Study on the After-Ripening Physiology and Endogenous Hormones of Ginkgo biloba Seeds
- 林业科学, 2006, 42(2): 32-37.
- Scientia Silvae Sinicae, 2006, 42(2): 32-37.
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文章历史
- 收稿日期:2005-03-02
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作者相关文章
银杏(Ginkgo biloba)种子属于典型的后熟类种子, 种子脱离母体后,并不具有萌发能力,需要一个后熟过程。生产上通常通过一段时间的层积处理完成后熟,解除休眠。研究表明:果实后熟期间种子内部的生理生化变化与种胚生长发育密切相关,历来是果树学和果树生理学研究的重点(曾骧,1992)。已有的研究还证实,赤霉素(GA)、细胞分裂素(CTK)和脱落酸(ABA)是与种胚发育密切相关的因子(Khan,1975),种子完成后熟具有萌发能力与抑制物的减少、促进物的出现以及“抑制物-促进物”的比例变化有关,取决于激素绝对量的消长和相对比例的变化(曾骧, 1992;李宗霆等,1996)。本文对银杏种子后熟过程中GA1+3、ZRs和ABA的含量变化及其种子内部的生理生化变化进行了研究,为揭示银杏种子后熟机理,指导种子贮藏和催芽奠定理论基础。
1 材料与方法 1.1 供试种子与采集处理试验用银杏种子采自山东省郯城县新一村,母树为1979年定植的实生树。于2001年7月20日、8月29日2次从母树分批采集种子进行试验,分批采收的种子先冰箱贮藏(2~5 ℃)备用,9月20日种子全面采收后,3次采收的种子室内常温干藏2个月,于11月20日脱去外种皮,经0.3% KMnO4消毒后转入2~5 ℃的室内冰箱层积,层积处理的种沙比均为1:3,沙子相对含水量60%~70%,定期翻动种子并检查温度与水分状况。翌春4月测定成熟胚大小。
1.2 试验方法 1.2.1 种、胚生长量测定用游标卡尺分批测定种长。自9月20日每隔15天左右测定1次胚长。每个重复25粒,3次重复。
1.2.2 种子呼吸强度的测定7月8日—9月6日每隔20天从母树采集种子1次,共采种4次,每次随机取样。在9月20日种子全面采收后室内常温干藏,11月20日转入2 ~5 ℃的室内冰箱冷藏,于9月26日、10月16日、11月6日、11月26日、12月16日、1月24日6次抽取样品,加之采集的种子样品共计10次取样。分别于采后或抽取样品当天,挑选无损伤的银杏种实为试验材料,去掉肉质外种皮、骨质中种皮,测定只带内种皮种子的呼吸强度。每次均在25 ℃用改进的气流法测定(于新等,1998)。
1.2.3 种子内代谢物质的测定取去除外种皮、中种皮,仅保留内种皮的种子测定。还原糖及淀粉含量的测定用3,5-二硝基水杨酸法(李合生,2000)。求得的直线回归方程 y=0.959x-0.02,相关系数R=0.998。分别测得总糖和还原糖,由总糖减去还原糖,得样品中淀粉含量。计算公式为:
还原糖含量(mg·g-1)=(C×V1/a)/W1;总糖含量(mg·g -1)=(C×V2/a)/W2 ×0.9,式中:C为标准曲线方程求得的还原糖(mg),V1、V2为提取液的体积(mL),a为显色时吸取样品液体积(mL),W1、W2为样品质量(g)。
银杏种子中蛋白质含量的测定用紫外分光光度法(李合生,2000)。计算公式为:蛋白质含量(%)=(1.45E280-0.74E260)×稀释倍数。
1.2.4 酶活性测定将层积处理后的种子,置于发芽箱内混湿沙发芽,发芽温度25 ℃,种子露白为种子萌动,1/3露白为种子萌动终止,胚根长超过1/2种长为发芽。分别测定不同阶段酶活性,α-淀粉酶用3,5-二硝基水杨酸还原法测定,过氧化氢酶用高锰酸钾滴定法测定(李合生,2000)。
1.2.5 激素样品的提取与测定分别将不同时期收集的银杏种子去除肉质外种皮和骨质中种皮,精确称取新鲜样品1 g,在研钵中剪碎并加80%冰甲醇10 mL,研细后转至150 mL三角瓶中,再加20 mL 80%冰甲醇后加塞,在超声波内振荡2 h(其间不断加入冰块, 保证温度低于4 ℃)过滤,滤渣中加入20 mL 80%冰甲醇,摇匀后放置冰箱过滤,然后合并滤液,再进行过滤。取10 mL滤液通过SepparC 18小柱,弃去滤出液,用20 mL乙腈冲洗SepparC 18小柱,收集洗出液,经0.45 μm滤膜过滤后,清液上HPLC分析。
测定GA1、GA3和ABA的色谱条件:Novapak C18 (0.4 cm×15 cm)柱,以40%CH3OH-15%CH3CN-45%H2O(用H3PO4调pH=4)为流动相,流速0.7 mL·min-1,检测器为UV254 nm×0.1AUFS。测定玉米素核苷(ZRS)的色谱条件:Novapak C18 (0.4 cm ×15 cm)柱,以15%CH3CN-25%CH3 OH-60%H2O(用H3PO4调pH=3.5)为流动相,流速0.7 mL·min-1 ,检测器为UV254 nm×0.1 AUFS。
2 结果与分析 2.1 种子后熟前后胚的形态解剖学特征研究发现,胚发育不充分是银杏种子后熟原因之一。对低温层积处理前后的种子进行形态和解剖观察,发现种子和胚的大小发生了明显变化,结果见图 1、表 1。
对8月29日采集的种子进行观测可以看出,从9月10日前仅有个别种子有米粒大小的球形胚出现到9月30日前后椭球形胚出现,胚生长近乎直线增加。对胚生长进行差异显著性检验(P < 0.05),可将胚的生长大致分为2个阶段,12月10日完成第1阶段,此后直至翌年2月20日各品种胚基本不再生长,3月份种胚开始第2阶段的恢复生长,为种子萌发胚根突破种皮做准备。结合种子发育来看,大多数种子的胚在种子外在形态成熟后才逐渐从无到有,种子个体间球形胚出现时间差别很大,胚长的变化在11月下旬之前还不稳定,这可能是银杏种子萌发不整齐的主要原因。
表 1显示,经5个月层积处理,完成后熟的种子比后熟前体积有所增大,种子长、宽、厚分别增长2.18%、0.77%、2.83%。胚的增长最为明显,未完成后熟的种子胚长仅为种子长的34.9%,后熟后,胚长达种子长的70.1%,增长35.2%。
2.2 不同时期银杏种子呼吸强度的变化不同时期分次采集的及9月20日全面采收后定期取样的银杏种子呼吸强度的变化如图 2所示。从7月8日种子的呼吸强度开始下降,7月8日—8月10日之间银杏种子的呼吸强度缓慢降低到最低点,说明这一阶段种子的物质代谢相对缓慢,从种子的形态发育角度看,这一阶段也正好是种子外部形态生长速度相对较慢的时期。至8月30日,种子受精渐次达到高峰期,此时细胞分裂和伸长生长旺盛,种子的呼吸强度开始上升,种子外种皮也逐步由青色渐转为黄绿色至黄色,表现为形态成熟特征。9月20日采收后呼吸强度急剧上升,约在10月10日左右,呼吸强度达最大值,这表明银杏种子属采后呼吸高峰型,这可能与种胚的后熟有关。11月10日以后,呼吸强度才急剧下降,低温层积期间呼吸强度一直保持在较低的水平。
银杏种子为淀粉性种子,种子内淀粉的积累及转化与发育阶段密切相关。不同时期银杏种子淀粉、还原糖含量的测定结果见图 3、4。
7月8日种子内还原糖和淀粉均已有了较高的含量,还原糖和淀粉含量分别为5.20%、34.25%;随后,种仁内还原糖急剧减少,8月31日至11月15日基本上稳定在0.11%~0.14%,12月20日以后直到种子萌发,还原糖含量持续缓慢增加。从7月8日到9月20日采收时淀粉含量增加快,淀粉含量达最大值50.12%,其后缓慢下降,10月20日到2月20日基本保持稳定,2月20日以后淀粉含量又有所增加。
纵观整个银杏种子发育过程,银杏种子形态生长期,种仁还原糖处于较高水平,用于种子生长。种子采收后和层积过程中,种仁还原糖含量维持较低水平,主要用于胚的形态建成;淀粉含量随种子的发育不断积累,种子完成形态成熟时达最大值,此后部分分解用于胚的建成。还原糖与淀粉的消长变化是种子自身发育及叶片光合作用产物转移、转化积累的结果。
2.3.2 不同时期银杏种仁中蛋白质含量的变化从图 5可以看出,7月8日采种种子中蛋白质已有了较高的积累,高达7.9%,8月10日前蛋白质含量持续增加,达到最大值15.25%,这段时期正是种子的形态发育时期。8月30日至10月20日蛋白质还有一个较小的增长期,此时正是胚的分化期。10月底种胚进入迅速生长期,大量消耗种子内贮藏的蛋白质,蛋白质含量开始急剧下降,到11月中旬伴随着胚的生长速度放慢,蛋白质含量基本上保持在5.0%左右。在层积过程中,银杏种仁中蛋白质含量也相对稳定。3月份种子具有发芽能力,萌发前蛋白质含量又有增加。
另外,从银杏种子不同时期蛋白质含量变化可以看出,8月10日左右种子内蛋白质含量最高,食用口味好,此时为采收加工“水白果”的最佳时期。
2.4 胚发育和酶活性的关系银杏属淀粉性种子,α-淀粉酶是其萌发过程中的重要酶类。对完成后熟的种子,在发芽条件下,分别测定了萌动期、萌动终止期和发芽期α-淀粉酶的活性,结果见表 2。结果表明:随胚根不断伸长,种子内α-淀粉酶活性逐渐增高。萌动期间α-淀粉酶活性增长较快,而萌动终止期到发芽期α-淀粉酶活性增长较慢。α-淀粉酶活性提高,有利于种子内淀粉水解,有利于种子萌发。
与α-淀粉酶变化相似,在萌发过程中过氧化氢酶活性也不断提高,其增加量几乎与胚根生长量成正比(表 2)。萌动期过氧化氢酶活性为28.856,到发芽期已达36.478。过氧化氢酶是与种子呼吸作用密切相关的酶。银杏种子萌发过程中过氧化氢酶活性提高,可能是通过呼吸作用刺激发芽。
2.5 种子发育过程中种仁GA1+3的变化试验中测得种仁内GA1+3含量的变化结果见图 6。可以看出,从7月20日至12月17日种子逐步形成具备一定的发芽能力,在这段时期内,GA1+3的变化经历了2个高峰期,每次变化都与种子和胚的形态变化有着极为密切的相关性:第1个峰值出现在8月30日左右,其后伴随着种子的形态成熟而含量下降。8月30日前后为种子受精高峰期,说明种子的受精作用对GA1+3影响极大(Nitsch,1965);第2个峰值出现在10月20日左右,此时正值种胚快速生长时期,同时与种子呼吸高峰同步(见图 2)。
种仁内ZRs含量的变化见图 7。从7月20日开始,银杏种子内ZRs含量已开始下降,8月30日左右下降到最低值,9月20日到11月初ZRs上升到一个高水平,这是胚分化和快速生长期,而后含量又下降,直到银杏种子具备了一定的萌发能力,说明ZRs影响种胚后熟但不是种子萌发的必需因子。
不同时期带胚种子内ABA含量的变化测定结果见图 8。结果显示,从7月20日开始测定,种仁内ABA的含量一直急剧下降。银杏种仁内ABA的含量在7月20日之前种子发育早期就已达到高峰值,这与有些研究结果一致,可能与细胞分裂有关。对照种胚的生长(图 1)变化,可知ABA含量的变化与种胚的发育呈显著的负相关。
早已证明(Khan,1975),种子休眠和萌发不仅与植物内源激素的绝对含量有关,还与各类激素之间的平衡、特别是促进生长的激素与抑制生长的激素之间的比例及平衡有关。3种激素的相对含量见图 9、10。从图 9看出,从7月20日到12月17日,GA1+3/ABA值接近直线上升,12月17日达到5.5,此时胚已基本上完成分化过程。从图 10看出,ZRs/ABA于8月10日先出现一个极小值,此时种子的形态成熟基本上完成,10月20日左右ZRs/ABA达到最大值,此时胚的生长正处于速生期。说明ZRs/ABA值与种胚分化有关,GA1+3/ABA值与种胚萌发能力有关。种胚发育过程中种胚萌发能力的提高与GA1+3/ABA值增加是一致的。
研究表明,胚后熟是银杏种子休眠的主要原因。银杏种子脱落时种子几乎完全被胚乳所充满,胚极小。采收后随胚的生长呼吸强度迅速上升,是典型的采后呼吸高峰型种子。层积的过程实质上是种胚不断生长的过程。
种子胚的发育过程中代谢方向与萌发方向是基本一致的,内源激素变化对代谢也有重要影响。ABA和ZRS在7月初之前达到高峰,至8月底下降到极低水平,由于脱落酸和细胞分裂素能够促进糖向果实的卸载(李宗霆等,1996;吕英民等,1999),受此影响种内还原糖也先于淀粉出现并快速积累,8月底迅速下降,二者表现出高度一致性;而此间(7月初至8月底)却是淀粉迅速增加时期。还原糖与淀粉之间的这种消长变化与种子生长发育密切相关(王建等,2000),早期还原糖的增加有利于种子的快速生长,种子形态发育后期淀粉的大量积累为种胚的后熟奠定了物质基础。采后和层积过程中,种子还原糖含量、淀粉含量增加,淀粉含量至翌年2月初开始减少。蛋白质的变化出现2个峰值,分别在形态成熟期和受精前期。低温层积阶段,蛋白质含量略有降低;层积达到一定阶段,蛋白质与还原糖含量增加,淀粉含量急剧下降,α-淀粉酶、过氧化氢酶的活性不断增强,休眠得以解除,种子开始萌发。
激素类物质能促进果实的发育(Crane, 1969),赤霉素(GA1+3)、脱落酸(ABA)和细胞分裂素(ZRS)在银杏种子后熟过程中扮演着重要角色,在诱导细胞分裂、促进细胞伸长及营养物质向果实转移等方面都具有重要的生理作用。与板栗(Castanea mollissima)(樊卫国等,2004)类似,银杏受粉后受花粉的刺激,种子中GA1+3含量迅速增加,受精期达到高峰,至种胚快速生长期仍保持较高的水平;GA1+3处于较高水平,有利于种子细胞分裂、伸长和种实发育所需的养分吸收。ABA在8月30日(受精期前后)直线下降,种胚形成和发育过程中仍持续下降,GA1+3/ABA值持续增加,ZRS/ABA则经历一个上升和下降的过程。说明GA1+3是种胚分化和发育的关键性物质,这种变化特点在很多果树上也有类似报道(张上隆等, 1999;牛自勉等,1996;周志翔等,2000)。
研究发现,7月20日后ZRS直线下降,8月30日(受精期前后)最低,9月20日(种子成熟脱落前后)又到达较高水平直至10月20日(胚分化期)再次下降,ZRS含量与种子生长尤其是胚发育缺乏相关性。但ZRS对银杏胚乳和配子体发育是必需的(邢世岩,1993),而配子体发育又是胚发育的营养源泉。说明各种激素之间以及对种子发育的调控存在复杂的相互关系。其调控作用的方式、部位及与其他因子的相互关系尚待进一步探讨。
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