植物的生长发育以及对逆境因素胁迫的响应均是一个多因素控制的复杂过程。许多研究证实，当植株受到微生物侵染后，多酚氧化酶(PPO)活性往往会发生较大幅度的变化(叶建仁等，1995; 张海保等，1996; 宋凤鸣等，1997; 段焰青等，2000)，这表明多酚氧化酶与植物的抗病性有密切关系。多酚氧化酶还可参与植物的生长、分化和种皮透性的调节(Mayer et al., 1979; 张建华等，1991;Gonzalezet al., 1991;姚延梼等，1998; 冯玉龙等, 2002)，在光合作用中发挥作用, 如能调节叶绿体中有害光氧化反应速度, 参与其中的电子传递(Trebst et al., 1995)。因此, 研究一些外源因子对植物体内多酚氧化酶活性水平及合成能力的影响, 一直受到关注, 这对于探索人工控制植物生长和提高抗逆能力具有重要意义。

近年来, 微量元素与酶活性关系的研究正在不断深入, 相关研究表明, 一些微量元素含量的改变会引起植物器官多酚氧化酶活性的变化(严景华等, 1997; 刘鹏等, 2000; 刘春生等, 2002;姚延梼等, 2002)。铜是某些氧化酶(多酚氧化酶、超氧化物歧化酶、抗坏血酸氧化酶等)的组成成分，是光合电子传递中有关酶及呼吸链中细胞色素氧化酶的组成成分，它还参与亚硝酸的还原反应，对植物生长发育具有不可替代的作用。锌是羧肽酶(AEC)、吲哚丁酸合成必需的色氨酸酶、碳酸酐酶等酶的组成成分，又是氨基酸脱氢酶、乙酸脱氢酶等酶的活化剂，与植物的各种生理活动和抗逆性密切相关。目前, 有关铜、锌元素在不同生育期对林木多酚氧化酶活性影响的研究尚未见报道。本文通过对华北落叶松(Larix principis-rupprechtii)苗木铜、锌处理后各器官多酚氧化酶活性变化规律的分析，探讨不同生育期铜、锌元素对多酚氧化酶活性的影响，为研究其对林木生长发育、生理代谢以及抗逆性等方面的影响提供基础资料和相关的理论依据。

1 试验地概况

试验地设在山西省关帝山森林经营局三道川林场苗圃(110°30′—111°54′E，37° 28′—37°35′N)，地处关帝山林区腹地，文水县西部，东西长30 km, 南北最宽处12 km, 最窄处5 km。天然林树种为油松(Pinus tabulaeformis)、山杨( Populus davidiana)、白桦(Betula platyphylla)等，华北落叶松为该区人工林的主要造林树种。灌木主要为沙棘(Hippophae rhamnoides)、山杏(Armeniaca sibirica)、绣线菊(Spiraea pubescens)等。草类有蒿草(Kobresia vidua)、唐松草(Thalictrum aquilegifolium)等。试验地海拔1 600 m，年平均气温3~8 ℃，年降雨量600~800 mm, 土壤为黄土、沙壤土，土壤含水量较高，且土壤中营养元素含量较低。

2 试验材料与方法 2.1 试验材料

将华北落叶松种子直播于经精细整地的苗床上，按常规育苗措施管理，在原圃地培养2年后，选择生长比较均匀(苗高和地径误差不超过5%)的苗木秋季人工移栽，翌年春季成活后进行各项处理和指标测定。

2.2 试验设计与处理

试验按完全随机区组设计，区组(重复)数为3，小区数为4，每个区组中各处理与小区随机对应。4个处理依次记为[Cu(0)，Zn(0)]，[Cu(0)，Zn(1)]，[Cu(1)，Zn(0)]，[Cu(1)，Zn(1)]。具体地，处理1：只用水处理作为对照; 处理2：只用ZnSO₄ ·7H₂O处理; 处理3：只用CuSO₄·5H₂O处理; 处理4：用CuSO₄ ·5H₂O与ZnSO₄·7H₂O的混合液处理。其中CuSO₄·5H₂O的浓度为1 900 mg·kg^-1, 铜含量为484.5 mg·kg^-1; ZnSO₄·7H₂O的浓度为2 200 mg·kg^-1，锌含量为501.6 mg·kg^-1。将CuSO₄· 5H₂O与ZnSO₄·7H₂O用温水溶解，按不同处理土施。

2.3 多酚氧化酶(PPO)活性测定 2.3.1 酶液提取

于树液流动期(3月10日)、生长初期(5月15日)、速生期(7月20日)、硬化期(10月20日)从试验地挖取苗木立即带回实验室，先用流动水将所取样品表面冲洗干净后，再用无离子水冲洗2~3次。用吸水纸吸干样品表面水分，分别称取叶、枝、干、主根(>2 mm)、侧根(< 2 mm)各待测鲜样0.500 0 g，加聚乙烯吡咯烷铜(PVP)0.25 g、少许石英砂和磷酸缓冲液(pH=6)，冰浴条件下充分研磨成匀浆，放入离心管，在10 000 r ·5min^-1条件下冷冻离心10 min，取上清液为酶提取液。

2.3.2 活性测定

参照Flurkey(1986)方法, 取3 mL磷酸缓冲液(pH6)和0. 3 mL上述酶提取液混合均匀，在室温条件下反应1 min, 立即加入1 mL 0.08 mol·L^-1邻苯二酚并摇匀，在722分光光度计420 nm波长处测其吸光度变化，每隔60 s读一次，共读5次并记录。依下式计算多酚氧化酶活性：PPO活性(U·g^-1)= ΔA ×D/(0.01W×t)。式中：以每分钟吸光度改变0.01为一个多酚氧化酶活性单位(U·g^-1)，ΔA 为反应时间内吸光度的变化，W 为鲜样品质量(g)，t为反应时间(min)，D 为总酶液反应系统内酶液的倍数。酶液的测定做2组重复试验，同时做对照。

3 结果与分析 3.1 华北落叶松各器官多酚氧化酶活性年变化规律分析

华北落叶松各器官不同生育期多酚氧化酶活性测定结果如图 1，结果表明，各器官在不同生育期多酚氧化酶活性有明显的差异，活性最高的干达225.2 U·g^-1，最低的是生长初期叶仅为57.3 U·g^-1。就同一器官来看，枝在不同生育期PPO活性差异最大，7月比3月增长255%;同一生育期各器官间PPO活性也有很大差异，如3月份侧根的PPO活性是枝的3.05倍。总的变化规律是:叶中PPO活性呈递增趋势，10月最高为151.2 U·g^-1; 枝中PPO活性3—7月递增，10月略有下降; 干、主根、侧根均表现出3月较高，5月下降，7月达高峰期，10月又有不同程度下降。

以上各器官PPO活性年变化规律说明，华北落叶松度过寒冷的冬季后，由休眠期转入树液流动期，开始生长发育，此时气温相对较低，树体自发地提高PPO活性来维持体内生理生化活动的正常进行，随着气温回升，土壤中微生物开始活动，多酚氧化酶由地下部向地上部回流，根系中PPO活性下降，而枝的PPO活性增强; 进入夏季，气温急剧升高，叶子的光合作用逐渐增强，酚类物质增多，各器官PPO活性也增高; 速生期树体生理活动最为活跃，处于生长的旺盛时期，此时各器官PPO活性均达高峰期，尤其是地上部分强生长点的PPO活性，这说明多酚氧化酶与华北落叶松的生长发育、生理代谢有关; 到了硬化期，叶中PPO活性又大幅度增加，这可能是叶片衰老前的生理反应，落叶前叶片细胞发生老化、衰退变化，容易受到许多病原菌的侵染，PPO活性提高可以抵御这些危害(宋凤鸣等, 1997)。其他器官的PPO活性在硬化期均有不同程度下降，但仍维持在较高水平，试验地海拔较高，10月份气温明显转低，树体能在气温较低的环境下通过自身生物调节来增加叶中PPO活性(Mayer, 1987)，以此来抵抗和维持其在低温下的过度性生长，说明多酚氧化酶也是树体抗寒性基础条件之一。另外，多酚氧化酶是一类与植物抗病性密切相关的末端氧化酶，通过病毒侵染后的寄主的诱导而活化，并引起寄主的过敏性反应，氧化酚类物质成为比病菌毒性更大的醌类物质(或其衍生物)而杀死病菌(张海保等, 1996; 王金胜, 1998), 限制病菌的扩展，从而在植物体内起到保护作用。速生期是树体病虫害的多发期，因此，这也是速生期PPO活性增高的原因之一。

3.2 铜、锌对华北落叶松各器官多酚氧化酶活性的影响

多酚氧化酶是与植物抗逆性密切相关的保护酶，与植物的生长发育也有一定相关性。从图 2可以看出，铜、锌处理后叶中PPO活性在5月和7月比对照都有不同程度提高，其中铜在5月、锌在7月的效应较为明显，而10月份仅锌处理的PPO活性略高于对照，铜及铜+锌有较明显的抑制作用，可见，铜作为多酚氧化酶的组成成分，在生长初期和速生期有助于PPO活性的增加，从而促进叶的生长发育; 对枝来说，在整个生育期铜和铜+锌处理对PPO活性的增加均有较大影响，最为突出的是10月份，分别比对照提高95.1%和128.5%，锌处理对PPO活性的影响不稳定，仅在7月份比对照有增加，其他月份有抑制作用; 铜及铜+锌对干的PPO活性在各月份都比对照有不同程度提高，其中5月份铜+锌处理后PPO活性最为明显，增加29.6 %，锌处理对干的PPO活性有抑制作用，10月份最明显, 比对照下降35.5%;铜、锌处理在整个生育期对主根PPO活性均有较大影响，依次为铜+锌、锌、铜; 侧根的PPO活性受铜处理影响最大，而锌处理在5月和10月抑制作用比较强，铜+锌也有增加PPO活性效应，但不如铜明显。各器官铜、锌处理后，其PPO活性发生明显变化，处理效应随器官不同而有差异，也与生育期有关，铜的直接作用要比锌大，二者互作在干、主根中对PPO活性增长也表现出明显的相互促进作用，这说明铜锌元素可以通过增加或抑制多酚氧化酶活性来影响华北落叶松苗木的生长和抗逆性。

对测定结果进行方差分析(表 1)表明，华北落叶松不同生育期、不同器官间PPO活性有极显著差异，铜锌处理对PPO活性也有显著的影响。各器官PPO活性经铜锌处理后依生育期不同而有所变化，处理的整体效应也不尽相同。就平均来说(表 2)，叶子中PPO活性10月、7月均极显著高于5月，处理间的PPO活性无显著差异, 但铜、锌处理的结果高于对照; 枝中PPO活性7月、10月极显著高于5月和3月, 铜+锌及铜处理的PPO活性极显著高于其他处理，锌处理与对照间无差异; 干中的PPO活性以7月最大，极显著地高于其他月份, 铜+锌处理的PPO活性显著高于对照, 锌处理有抑制PPO活性的作用; 主根中各生育期PPO活性的差异达极显著水平，7、10月份极显著地高于5月，而3月也显著超过5月，处理间有极显著差异，铜+锌处理的PPO活性显著地高于铜处理和对照，铜处理与对照间的差异不显著; 侧根中PPO活性在不同生育期也有极显著差异，7月极显著地高于5月，而3月、10月次之，铜处理的PPO活性显著地高于对照，锌及铜+锌处理与对照间无显著差异。

以上分析表明，铜锌处理在整个生育期对各器官PPO活性都有较为显著的影响，处理效应最为突出的是枝，铜+锌及铜处理后的PPO活性分别是对照的150.2%、145. 5%。铜的主效应在枝、干和侧根中极为明显，都能显著增强PPO活性, 对叶和主根也高于对照; 锌的主效应主要表现在干和根, 锌处理能显著增强主根的PPO活性, 而对干和侧根的PPO活性有抑制作用; 铜+锌在枝、干、主根中能显著地提高PPO活性。就植株体内PPO活性的整体水平来说，处理效应在各生育期也不近相同(表 3)，在3月、5月处理效应不显著，但铜及铜+锌处理的PPO活性均明显高于对照; 7月、10月各处理的PPO活性均显著高于对照。总之，铜处理后华北落叶松苗木各器官多酚氧化酶活性比对照有显著的提高，铜作为多酚氧化酶的辅助因子，对PPO活性的增加的直接作用更为明显、稳定，锌的直接作用很有限，主要是通过与铜及其他元素相互作用而间接影响着PPO活性的变化，铜锌互作表现出较强的协同作用。

3.3 华北落叶松多酚氧化酶活性与铜、锌元素含量的相关性

华北落叶松苗木各器官不同生育期PPO活性与相应铜、锌元素含量的相关系数见表 4，叶中PPO活性与铜含量的相关程度在5月、7月均达极显著水平，相关系数分别为0.943 1、0.989 5，这说明铜在叶子生长发育过程中有利于PPO的合成。10月份二者呈显著的负相关，表明落叶前的一段时间内叶中铜元素大量回流，而多酚氧化酶回流很少，随落叶进入林地; 枝、干中PPO活性与铜含量的相关在3月份达极显著水平、10月达显著水平，可见，多酚氧化酶与华北落叶松苗木的抗寒性密切相关，是华北落叶松苗木抗寒性的基础条件之一; 根系中PPO活性与铜元素的相关性不如地上部，仅在3月份达显著水平。整体来说，华北落叶松苗木体内铜元素含量与PPO活性呈显著的正相关。锌元素含量与PPO活性的相关性除干、主根在7月、10月达显著水平外，其他大多数情形相关程度较低。这表明在试验地条件下，华北落叶松苗木生长过程中其体内锌元素含量与PPO活性相关性不明显。

4 结论与讨论

多酚氧化酶广泛存在于植物体的各种器官或组织中, 它与植物的抗病性呈正相关(叶建仁等, 1995; 宋凤鸣等, 1997; 段焰青等, 2000)。黄晋玲等(1999)研究了20年生华北落叶松各器官多酚氧化酶活性的变化规律, 枝、干、根中PPO活性的峰值出现在9月份, 叶中在8月份, 而后下降。本研究对3年生华北落叶松幼苗各器官PPO活性的测定也得到了基本相似的结果, 不同之处在于峰值出现的时期略有差异, 幼苗叶中PPO活性5—10月呈递增趋势; 枝、干、主根、侧根中PPO活性的峰值均在7月下旬, 而且到10月份主根和侧根中PPO活性仅比峰值下降5%左右, 仍维持在较高水平, 可能是由于苗木与成年林木相比, 苗体嫩小, 幼苗生长后期苗叶易受病菌侵染以及苗体抗寒能力较弱所致, 这初步说明多酚氧化酶也是树体抗寒性基础条件之一。据有关报道，多酚氧化酶活性与植物生长的关系还不是很确定，Gonzalez等(1991)证实多酚氧化酶活性与榛子(Corylus heterophylla)生长呈负相关, 张建华等(1991)研究表明它与无腺体棉苗生长呈不同程度正相关, 冯玉龙等(2002)发现多酚氧化酶活性与长白落叶松(Larix olgensis)的生长呈一定的负相关。7月份华北落叶松苗木进入旺盛生长时期, 呼吸作用、光合作用和其他代谢活动逐渐增强, 本研究中此时期各器官(除叶外)多酚氧化酶活性达到峰值, 间接说明多酚氧化酶活性的提高也有助于华北落叶松苗木的生长。

正常状态下, 细胞多酚氧化酶与质体、线粒体等细胞器内膜相结合, 活性较低, 某些离子积累、环境酸化、膜破坏及表面活性剂的使用等, 可激活潜在的多酚氧化酶活性(Mayer, 1987)。对多酚氧化酶性质、提取和动力学特性已作了不少研究(谭兴杰等, 1984; 季孔庶等, 1991; 韩富根等, 1995; 张淑改等, 1999), 结果表明, Cu²⁺作为一种激活剂，直接刺激到原有同工酶的一个酶原，产生酶原激活，使原有同工酶活性增强。刘春生等(2002)证实适量铜能使果树叶片的多酚氧化酶活性增强, 姚延梼等(2002)对华北落叶松一个生育期铜锌元素与酶活性关系的研究表明, 适量铜元素可增强侧根、干、主根和枝多酚氧化酶活性, 锌元素抑制了叶、枝、主根和侧根多酚氧化酶活性。本研究结果表明, 铜处理对华北落叶松苗木各器官多酚氧化酶活性均有明显提高, 其中10月份铜处理后枝中PPO活性比对照提高95.1%, 3月份仅比对照提高13.5%, 这说明铜元素对多酚氧化酶活性的影响与器官有关, 而且也与生育期有关, 就4个生育期平均来说, 铜处理能增强多酚氧化酶活性的器官顺序为:枝>侧根>叶>干>主根; 锌处理仅在10月份对主根、7月份对叶PPO活性提高有较明显的作用, 而在其他情况下则有不同程度的抑制作用, 10月份锌处理后干中PPO活性比对照下降35.5%, 它对PPO活性的影响大多体现在与铜及其他元素的相互作用, 铜、锌互作对增强枝、干和主根PPO活性表现出较明显的协同作用。

从铜、锌元素对华北落叶松苗木体内PPO活性整体水平的影响来说, 3月、5月各处理间无显著差异, 但3月份铜及5月份铜+锌要明显高于对照, 而锌均略低于对照，有抑制作用; 7月份各处理都显著高于对照, 表明在苗木速生期铜、锌及铜+锌均能增强苗体的PPO活性, 有利于苗木生长; 10月份铜+锌显著高于其他处理, 锌有较强的抑制作用, 表明在硬化期铜+锌能使苗体PPO活性显著增强, 从而提高苗体的抗病和抗寒能力。相关分析表明，苗木体内铜元素含量与多酚氧化酶活性呈显著的正相关。铜、锌元素通过影响PPO活性来影响苗木的生长发育和抗逆性，其机制有待进一步探讨。