大熊猫是中国特有的珍贵稀有活化石动物，属国家Ⅰ级保护野生动物，并被列入CITES公约。由于食性的高度特化、生殖能力的高度特化、栖息环境的相互隔离，以及天敌、疾病等因素的影响，大熊猫的数量已十分稀少(冯文和，1991)；根据第三次全国大熊猫资源调查，野外仅存1 596只(赵学敏，2004)。因此，为拯救这一濒危物种，在加强大熊猫自然保护的同时，开展作为保护和保存受威胁物种最重要措施的人工饲养繁殖及其营养需要的研究已势在必行, 而营养需要研究的侧重点又在于蛋白质和能量研究。前人这方面的研究相对较少，主要涉及人工饲养大熊猫消化率的测定(胡元玉，1994；张贵权等，1996；周幼英，1987；邹兴淮等，1991a; 1991b；Dierenfeld et al., 1982)、蛋白质和氨基酸定量分析(吕向东，1986；刘选珍等，1997；王爱民等，2002；王宝等，1996；邹兴淮等，1996a; 1996b)、以及提高粗纤维消化率的方法探索(陈玉村等，1995; 1997；爱德华兹，1997；张定军等，1996；周汉林等，1996)。纵观前人研究报道，从消化试验研究方法来说，或是仅测定某1只或2只大熊猫的消化率而未进行统计分析，或是仅对单一因素进行单因子统计分析，尚未发现对2种影响因素同时进行考察的报道。

本研究首次将双因子交叉分组试验设计应用到大熊猫营养需要研究中，通过考察精料的蛋白质水平和能量浓度对日粮消化率影响的显著性，探索成体大熊猫精料的适宜蛋白质水平及能量浓度，为日后配制大熊猫全价日粮提供科学依据和参考，并改善目前移地保护饲养大熊猫营养不平衡的状况，促进移地保护大熊猫健康生长发育，提高机体免疫力，减少疾病的发生，进而提高繁殖机能，达到移地保护的目的。

1 材料与方法 1.1 试验地点与试验动物

试验外业部分(消化试验)在位于汶川县的中国保护大熊猫研究中心完成，“中心”地处青藏高原向四川盆地过渡的地带，1983年，由WWF和我国原林业部合作建立(胡锦矗等，1985)。试验动物为选自该中心的4只健康且驯化良好的成体大熊猫——壮壮、大地、雷雷、22#。试验内业分析(样品实验室分析、数据处理等)在东北林业大学野生动物营养学实验室完成。

1.2 试验设计 1.2.1 试验方案设计

采用双因素交叉分组试验(又称两向分组试验或复因子试验)(杨永年，1990)，考察精料的蛋白质水平和能量浓度这2个因素，每个因素安排2个水平，共有4(2×2)种处理(表 1，2)。以日粮各营养成分及总能量的消化率为试验指标。

1.2.2 精料配方设计

根据大熊猫消化系统解剖特点及消化生理特异性(吕益新，1966)，参考历年各地大熊猫饲养实践(Dierenfeld et al., 1995)和当地的饲料资源状况，在基本不改变精料原料种类的前提下，通过变更原料的配比，用文献¹⁾介绍的线性规划程序配制2种蛋白质水平、2种能量浓度搭配的4种精料(精料1：CP2, GE2；精料2：CP1，GE2；精料3：CP1，GE1；精料4：CP2，GE1)(配方见表 3，营养水平见表 4)。设计饲料配方及计算饲料营养水平时，饲料原料的蛋白质含量及热价(能量值)引自《中国饲料成分及营养价值表》(中国农业科学院畜牧研究所，中国动物营养学会，1985)。

1) 张子仪，陈绪生，卢书勤，等.1985.饲料配方线性规划程序.见：北京市饲料顾问团，北京地区饲料科技情报网编.配合饲料技术学习班讲义

1.3 试验方法

试验前驱虫。4只大熊猫分别单圈饲养, 各进行每期12 d(预试期4 d, 正试期8 d)的5期(试验日粮4期, 对照常规日粮1期)全收粪法消化试验(邹兴淮，1990)。按精料配方准确称量，充分混匀，每日蒸制成窝窝头，与竹子一同喂给受试大熊猫。窝头日喂4次，鲜竹2次，每次投喂时都将前一次吃剩的捡出并称质量。自由饮水。每日清晨清扫，分别将各猫所排粪便收集于干净塑料袋中，称质量。由于投喂竹与剩竹两者质量之差是由大熊猫采食量与吃剩竹自然蒸发失水量2部分组成，所以于每日投竹时取空白样对“失水量”进行校正，计算时保持一致。

每天观察大熊猫的精神状态、采食情况、粪便性状、竹子种类等并详细记录。如遇排粘，则排粘前后1~2 d的试验作废，试验期顺延。

1.4 样品采集与制备

每天采集窝头、竹子、粪便样品(同一期试验各天，粪便按全天排粪总量的同一比例取样)，65~70℃烘干(窝头12 h，竹子6 h，粪便24 h)，制得半干样本，求出半干物质(%)。将每猫每试验期8 d所采集并制成半干物的样品分别粉碎，过40目筛，“四分法”取200 g半干样本供分析用。

1.5 样品分析

采用饲料测定的范氏(van Soest)体系测定(计算)窝头、竹子、粪便样品的各营养成分(水、粗蛋白、粗脂肪、粗灰分、无氮浸出物、纤维各组分即半纤维素、纤维素、木质素)及能量含量(杨胜，1993；van Soest，1963；van Soest et al., 1967)。

干物质:烘干法，将样品在恒温烘箱中于105℃下烘干至恒重得到干物质。粗蛋白:Kjeldehl半微量定氮法，测得的含氮量乘以6.25，即为粗蛋白含量。粗脂肪:Soxhlet提取法。纤维各组分: van Soest洗涤纤维法。用Tecator纤维测定仪(cellulosetec system)测定。样品依次进行:1)丙酮脱脂；2)中性洗涤剂洗涤；3)酸性洗涤剂洗涤；4)72%硫酸浸泡；5)茂福炉中500℃灰化。中性洗涤后的不溶物即为中性洗涤纤维(NDF)，酸性洗涤后的不溶物为酸性洗涤纤维(ADF)。

NDF-ADF=半纤维素，ADF-72%硫酸浸泡后残渣=纤维素，72%硫酸浸泡后残渣-500℃灼烧后灰分=酸性洗涤木质素(ADL)。无氮浸出物：为一计算值。无氮浸出物(%)=100%-(水分%+粗蛋白%+粗脂肪%+NDF%)=干物质%-(粗蛋白%+粗脂肪%+NDF%)。总能量：氧弹燃烧法。用氧弹式热量计(GR-3500型，长沙仪器厂)及其配套计算机软件测定样品热价(能量浓度)。

为使分析结果便于比较，各种营养成分及总能量含量均以干物质基础计。

1.6 数据处理

样品各营养成分及能量百分含量计算、消化率计算，以及消化率方差分析均采用Excel分析处理(邵丽，1998；周德镇，1997)。

1) 对前4期消化率进行双因素方差分析(考虑交互作用)，考察CP、GE二因素对消化率的影响

① 提出统计假设：假设二因素对消化率无显著影响。②计算统计量：

L_A、L_B、L_A×B、L_e分别为因素A、B、A与B的交互作用、A×B及随机因素的离差平方和。a、b为A、B的水平数，m为重复数。本研究中，a=2, b=2, m=4。

③ 列方差分析表，求出F_A, F_B, F_A×B，并与F_α比较。④得出结论：若F>F_α，则拒绝假设，认为相应的因素对消化率有显著影响；否则，接受假设，认为相应的因素对消化率无显著影响。

2) 用LSR法对1—5期消化率进行多重比较，判断两两之间有无显著差异

① 计算标准误差，其中m为重复数(本研究有4只大熊猫，故m=4)，S_e²为误差项均方。

② 计算显著性尺度LSR=SSR×S_x，其中，SSR由邓肯多重极差检验表查得(查表时，K为检验范围内平均数的个数)。③将各处理消化率平均值依从大到小排列，然后再依次减去各平均值，得。④若||>LSR, 则与差异显著。

2 结果 2.1 消化率

4只受试大熊猫对5种日粮中DM及其中各种营养成分及能量的消化率如表 5所示。

2.2 前4期消化试验消化率的双因子方差统计分析

将各试验期每项消化率按精料的蛋白质水平(CP)和能量浓度(GE)进行双向分组，并统计分析(陈华豪，1992)，考察这2因素及其交互作用对消化率的影响。分析结果见表 6。

由表 6可见，精料的蛋白质水平对粗蛋白和粗脂肪的消化率均产生了极显著影响(P＜0.01，正相关)；精料的能量浓度对粗蛋白的消化率产生了显著影响(P＜0.05，负相关)；二因素交互作用对粗蛋白消化率产生了显著影响(P＜0.05)；二因素及其交互作用对其余各项消化率均未产生显著影响(P>0.05)。

2.3 1—5试验期消化率的多重比较日粮配方的优选

采用邓肯多重极差检验法(LSR检验法)(陈华豪，1992)对1—5试验期两两之间进行多重比较。检验结果如表 7所示。

从表 7看出，粗蛋白消化率，第4期与其余各期均有显著差异，其余各期即5，1，2，3期两两之间均无显著差异。粗脂肪消化率，达到显著差异的有：4与3，4与5，1与3，1与5，2与3，2与5期；其余两两之间(即4与1，4与2，1与2，3与5期)无显著差异。

除粗蛋白(第4试验期显著高于其余4个试验期，其余4个试验期两两之间无显著差异)、粗脂肪(第4、1试验期显著高于第2、3、5期，4、1期之间，2、3、5期之间均无显著差异)外，其余各项消化率各期两两之间均无显著差异。第4试验期对粗蛋白、粗脂肪、干物质、总能量的消化率均是5期中最高的(前两项消化率达到显著水平)，因此，第4种精料配方(CP2×GE1, 即CP20.61%×GE18.08 MJ·kg^-1)是本研究的优选配方。

3 讨论

本研究中, 试验指标——消化率是表观消化率，由于表观消化率对矿物质没有实际意义(杨凤，1991；邹兴淮，1990)，因此未计算粗灰分的消化率。

由于本研究是在不改变精饲料原料的基础上设计的饲料配方，所以，所考察的二因素CP、GE的2个水平(CP为18.9%和20.6%, GE为18.1 MJ·kg^-1和19.5 MJ·kg^-1)很难拉开较大差距, 可能效果不理想, 有待今后改进。

由于受试验动物所限，重复数(4)较少，因此一定程度上增大了组内误差。同时，由于试验时间跨度较大(11月上旬至翌年1月上旬)，这期间大熊猫由喜食竹叶转向喜食竹秆。此外，除饲料外，消化率还与动物的消化力有关。因此，本研究所得结果是否具有重演性，还有待于进一步验证。

尽管如此，本研究还是在大熊猫营养需要方面进行了一些探索：首次将2×2因子设计运用到大熊猫消化试验设计；每期消化试验用相同的受试大熊猫，实质是将统计学上的成对动物试验加以引申和发展；正试期(8 d)较长；每次投喂都取样，每天取竹子空白样矫正失水率。这些措施最大程度地保证了试验结果的真实性。

本研究中，各试验期日均采食DM量(1.6~2.4 kg)均比野外估计值(5.18~7.20 kg) (胡锦矗等，1985)少得多，各期对竹子DM采食量(0.74~1.19 kg)也均比野外(6.25 kg)(胡锦矗等，1985)少得多，而与圈养的(1.55 kg，或2~4 kg)(王雄清，1989；王雄清等，1997；汤纯香，1992)相差则不大。究其原因，主要是因为圈养大熊猫受条件限制，活动量少，能量需要少，所以采食量少；由于摄入营养丰富的精饲料，从而减少了食竹量。

本次研究中，大熊猫对日粮中性洗涤纤维消化率较低(30%左右)，这与前人的报道一致(陈玉村等，1995)。竹子细胞壁的纤维成分能抗化学侵蚀，而大熊猫消化系统与草食动物相比有许多不同，如消化道短、单室胃、无盲肠等(吕益新，1966)，因而对纤维的消化能力极其粗糙，吃进的竹叶和竹茎，大部分被完好得排出体外，粪便中竹便由1~4 cm长未被消化的短竹叶及一段段的竹片、竹茎组成。

精料的蛋白质水平CP对粗蛋白的消化率影响极显著(P＜0.01)，原因是饲料中高的蛋白含量有利于动物消化液的分泌和养分的充分消化(杨凤，1991)。此外，圈养大熊猫肠道来源的含氮物除菌体蛋白、肠粘膜、消化酶外，还有包裹于粪团表面的粘液(经分析为粘蛋白)。据报道，代谢性粪氮与饲料干物质之比为一定值，饲料中蛋白越多，则从代谢粪氮损失的蛋白相对越少，消化的相对越多，从而提高了表观消化率(颜宏运，1985)。

4 结论与建议

精料的蛋白质水平对日粮中粗蛋白和粗脂肪的消化率均产生了极显著影响(P＜0.01，正相关)；精料的能量浓度对粗蛋白的消化率产生了显著影响(P＜0.05，负相关)；二因素交互作用对粗蛋白消化率产生了显著影响(P＜0.05)；二因素及其交互作用对其他各项营养物质消化率影响不显著(P>0.05)；多重比较结果显示，精料配方4(CP2×GE1, 即CP20.61%×GE18.08 MJ·kg^-1)为本研究的优选配方。本研究结果说明，精料的蛋白水平及能量浓度都对成体大熊猫消化率产生了一定影响，成体大熊猫似乎倾向于高蛋白、低能量的精料。

鉴于此，建议饲养实践中应适当提高成体大熊猫精料的蛋白质水平以满足维持需要和生产(繁殖)需要，并应注意控制能量浓度以防止过肥影响繁殖机能，同时应注意适当的蛋白/能量比，以便既节省饲料蛋白质，又保证能量的最大利用效率。