磷是植物必需的营养元素之一。我国土壤中的总磷量相当可观，但95%以上的磷以稳定的铝硅酸盐和磷灰石等无效形式存在(陈延伟等, 1960)，植物很难直接利用。因此绝大多数农作物及林木都要追施磷肥。目前主要施用的速效磷肥生产成本高、能耗大，施入的磷肥当年利用率仅为10%~25%(张宝贵等, 1998)，一部分磷肥随雨水流入江河湖泊，造成水体的富营养化，引起水质污染(李发云等, 1997)；另一部分磷与土壤中的Ca²⁺、Fe²⁺、Fe³⁺、Al³⁺等结合，形成难溶性磷酸盐(赵小蓉等, 2001)，植物无法吸收利用。因此，提高磷的利用率一直是土壤学家关注的问题。微生物对土壤磷的转化和有效性影响很大，其本身有无毒无害、不污染环境、成本低、节约能源等特点，应用生物技术提高土壤养分的有效性和化肥的利用率, 具有重要的理论价值和实践意义(陆文静等, 1999), 目前对该领域确切的研究结果，国内外报道甚少，而我国主要造林树种如杉木(Cunninghamia lanceolata)、马尾松(Pinus massoniana)等，对磷的需求量大，是制约其生长的重要因子(陈竣，1996)，本文就部分细菌肥料菌株对难溶性磷转化的状况进行探索性研究。

1 试验材料 1.1 菌株

1) Pseudomonas fluorescens Migula PT, 2) Microcococcus sp., 3) Serratia sp., 4) Arthrobacter sp., 5) Agrobacterium radiobacter (Beijerinck and van Delden) Conn, 6) Pseudomonas fluorescens Migula KO, 7) Flavobacterium sp., 8) Pseudomoas sp.1217，9) Bacillus subtilis(Herenberg) Cohn。

以上菌株除了Serratia sp.从俄罗斯引进外, 其余均为本实验室从杉木、马尾松、杨树(Populus sp.)等0~40 cm森林土壤中分离出来。

1.2 培养基

1) 斜面培养基King's bagar培养基(中国微生物菌种保藏管理委员会, 1992)。

2) 无机磷细菌筛选培养基(李阜棣等，1996) 100 mL基础培养基(基础培养基：葡萄糖10 g，酵母粉0.5 g，CaCl₂ 0.1 g，MgSO₄·7H₂O 0.25 g，蒸馏水1 000 mL琼脂2 0 g分装在三角瓶中110 ℃灭菌30 min)熔化好，加入灭菌的20 mL 10%CaCl₂与2 mL 10% K₂PO₄混合液(产生大量白色沉淀)混匀，用灭菌的0.1 mol·L^-1NaOH调节pH至7.0, 倒平板。

3) 有机磷细菌筛选培养基(李阜棣等，1996)牛肉蛋白胨培养基加卵磷脂，卵磷脂的制作方法如下：用75%酒精棉球擦净鸡蛋外壳，用灭菌的注射器从鸡蛋中抽取蛋黄至一空试管中，加入等量的灭菌生理盐水充分摇匀，制成蛋黄液。按每100 mL牛肉蛋白胨培养基加6 mL蛋黄液的比例在无菌操作下把蛋黄液加入到冷却到45 ℃左右的培养基中，摇匀后倒平板。

4) 摇瓶培养基(郑传进等，2002)无机磷培养基：葡萄糖10 g, (NH₄)₂ SO₄ 0.5 g, MgSO₄·7H₂O 0.3 g，NaCl 0.3 g，KCl 0.3 g，FeSO₄·7H₂O 0.03 g，MnSO₄·7H₂O 0.03 g，Ca₃ (PO₄)₂ 5 g，蒸馏水1 000 mL，pH 7.2，110 ℃灭菌30 min；有机磷培养基：葡萄糖10 g，(NH₄)₂ SO₄ 0.5 g，MgSO₄·7H₂O 0.3 g，NaCl 0.3 g，KCl 0.3 g，FeSO₄·7H₂O 0.03 g，MnSO₄·7H₂O 0.03 g，卵磷脂2 g，CaCO₃ 5 g，蒸馏水1 000 mL，pH 7.2，110 ℃灭菌30 min。

2 试验方法 2.1 磷细菌的筛选

待无机磷细菌筛选培养基和有机磷细菌筛选培养基平板凝固后，每个菌株每种培养基各接种3皿，每皿上选3个点分别接种已活化3次的要检测的细菌肥料菌株，28 ℃培养3 d，检查菌落周围是否出现透明圈。若在无机磷筛选培养基上出现透明圈，则说明该菌株能使难溶性Ca₃(PO₄)₂转化为可溶性的有效磷；若在有机磷筛选培养基上出现透明圈，则说明该菌株可分解卵磷脂(李阜棣等，1996)。

2.2 磷细菌解磷能力的测定

将筛选出来的既可转化难溶性无机磷Ca₃(PO₄)₂、又可转化有机磷卵磷脂的9个菌株，进行磷的转化强度试验及培养液pH测定。实验菌株经过活化后接入摇瓶培养，用接种针粘取1环接入盛有200 mL已冷却的灭菌培养液的摇瓶中，25 ℃，150 r·min^-1摇床培养，镜检培养物中细菌数量达到10⁹个·mL^-1时为培养终点。无机磷细菌培养液振荡培养5 d，有机磷细菌培养液振荡培养3 d，每个菌株每一培养基3个重复，对照接入一环经灼烧致死的菌苔。

2.3 培养物的处理及有效磷含量的测定

将培养物通过超声波细胞破碎机进行细胞破碎，使之释放出细胞内的有效磷，然后进行离心。无机磷培养液的上清液可以直接用钼锑抗比色法测定培养液中的有效磷；有机磷培养基的上清液按每30 mL加入15 mL 0.1 mol·L^-1的盐酸振荡15 min，再加入无磷活性碳1 g, 充分摇匀，减压过滤至滤液清亮，然后用钼锑抗比色法测定培养液中的有效磷。

2.4 pH测定

培养物经离心后的上清液直接用pH计进行测定。

3 结果与讨论 3.1 无机磷筛选

培养基以Ca₃(PO₄)₂作为唯一的磷源，接种试验室已有的细菌肥料菌株中筛选出的具有分解Ca₃(PO₄)₂形成透明圈的菌株，其中既可分解无机磷又能分解有机磷的菌株共9株。图 1为9菌株在培养基上形成的溶磷圈。从图 1可以看出：这些菌株分解无机磷Ca₃(PO₄)₂的能力不同，形成的透明圈的直径在0.5~2.5 cm范围内，透明圈范围内的无效磷均已被细菌转化成有效磷。这在理论上具有一定的意义，因为无菌根植物无法利用离根表1cm处的磷(Gianinzzi-Pearson, 1978；Kim，1995)。细菌肥料的施用，使植物根系的磷消耗区可从根基向远处扩展。同时由于根系对磷细菌具有一定的牵引作用，根面中解磷细菌的含量分别是非根际区和根际区的18倍和6倍(Katznelson, 1962)，这大大增加了植物对磷的利用。

3.2 分解有机磷卵磷脂菌株的筛选

有机磷细菌筛选培养基以卵磷脂为唯一磷源，接种试验室所有的细菌肥料菌株，筛选出既可分解无机磷又能分解有机磷的菌株共9株，9个菌株在培养基上形成的透明圈见图 2。从图 2可以看出：有机磷细菌筛选培养基特别适合Serratia sp.、Pseudomonas fluorenscens PT、Pseudomonas fluorenscens KO、Pseudomonas sp. 1217、Arthrobacter sp.生长，特别是Serratia sp.、Pseudomonas fluorenscens PT、Pseudomonas sp. 1217不但其生长速度快，且对有机卵磷脂的搬运能力很强，这3个菌株均可把培养基边缘部分的卵磷脂富集到菌落周围形成淡黄色圈，而培养基边缘部分已透明，基本上无卵磷脂；Pseudomonas fluorenscens KO、Arthrobacter sp.虽然其菌落生长较快，但形成的溶磷圈却很小，这可能意味着这几个菌株转化能力较差；Flavobacterium sp.、Agrobacterium radiobacter及Micrococcussp.虽然菌落生长相对较差，但所形成的溶磷圈与菌落相比却较大, 其单位数量分解卵磷脂的能力并不一定差。这些推断可以通过下面磷的转化强度试验得到验证。

3.3 无效磷向有效磷转化的强度

将筛选出来的既可转化难溶性无机磷、又可转化有机磷卵磷脂的9个菌株分别接种到以Ca ₃(PO₄)₂及卵磷脂作为磷源的摇瓶培养基内，测定培养液中有效磷的含量，结果如表 1。从表 1可以看出：细菌对无机磷Ca₃(PO₄)₂的转化强度较大，与对照相比其培养基中有效磷含量增加了32.122~343.86 mg·kg^-1, 在α=0.05水平上，与对照相比均达到差异显著，在α=0.01水平上与对照相比均达到差异极显著。菌株之间的差异很大，转换能力强的Microcococcus sp.其转化能力是Arthrobacter sp.的10倍以上；与此相应的是细菌对有机磷卵磷脂的转化强度较低，在α=0.05水平上，与对照相比除Pseudomonas fluorescens KO、Bacillus subtilis(Herenberg) Cohn外其他7个菌株达到差异显著，与对照相比其培养基中有效磷含量增加了2.342~42.973 μg·mL^-1, 菌株之间的差异很大，转换能力强的Pseudomoas sp.1217其转化能力是Bacillus subtilis(Herenberg) Cohn.的59.7倍。这充分说明针对需求进行菌株筛选的必要性。在磷细菌筛选过程中，有机磷细菌生长较好，其形成的透明圈也较大，但在磷的转换强度实验中，其转化强度反而低于无机磷的转化，这可能是由于摇瓶培养无机磷细菌易于分散，且无机磷Ca₃(PO₄)₂被菌株分解后其菌体内也主要以无机态存在；而有机磷被菌株分解吸收后，仍有部分磷以有机态磷存在于细胞内，所以其有效磷含量反而低于以Ca₃(PO₄)₂为唯一磷源的培养基中的含量。

3.4 磷细菌生长过程中发酵液pH变化

从表 2可以看出，与对照相比，无机磷Ca₃(PO₄)₂作为唯一磷源的培养液，pH值有不同程度的下降，其范围在5.80~6.25，这可能与细菌代谢过程中, 或分泌有机酸、或通过呼吸作用释放出CO₂降低周围的pH值，促进Ca₃(PO₄)₂的溶解, 释放出有效磷有关；有机磷卵磷脂作为唯一磷源的培养液中, 与对照相比，除Flavobacterium sp., Bacillus subtilis(Herenberg) Cohn 2个菌株上升外, 其余菌株均有不同程度的下降, 可能这2个菌株其碱性磷酸酶起主要作用。

3.5 磷的转化能力与培养物pH的关系

从表 1和表 2可以看出，无论是无机磷还是有机磷培养液pH与磷的转化量之间并不存在线性相关关系。

4 存在问题及展望

在磷转化强度试验中, 无效磷转化为有效磷过程中起决定作用的酶及其他与磷转换相关的物质究竟为何, 还需要进一步研究。

针对我国不同土壤磷的存在状态不同，进行不同磷源试验，筛选出适合不同土壤类型的磷细菌，更好地发挥磷细菌的解磷作用。