文章信息
- 姚斌, 尚鹤, 韩景军, 梁景森.
- Yao Bin, Shang He, Han Jingjun, Liang Jingsheng.
- 重金属及有机污染土壤转基因植物修复研究进展
- Application of Transgenic Plants in Phytoremediation for Contaminated Soil by Heavy Metals and Organic Pollutants
- 林业科学, 2005, 41(4): 162-167.
- Scientia Silvae Sinicae, 2005, 41(4): 162-167.
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文章历史
- 收稿日期:2004-02-13
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作者相关文章
随着工农业生产的迅速发展,进入土壤环境中的有毒有害物质日益增多。重金属和有机物是2种主要的污染源。农业生产活动中的污灌、污泥农业利用、农用化学物质施用和工业生产活动中的矿山开采冶炼、汽车尾气排放等,使许多土壤被重金属和有机物污染,这已成为全球关注的环境问题(Nriagu et al., 1988;Schnoor et al., 1995;陈怀满, 1996)。土壤中重金属和有机物污染已对水土生态环境和人体健康构成了严重威胁(Schnoor et al., 1995;张从等,2000)。它们不仅使土壤肥力退化、降低作物产量与品质,恶化水环境,并通过食物链危及人类的生命和健康。因此,对污染土壤进行修复研究已成为国际土壤环境科学领域的前沿和研究热点。20世纪80年代以前,重金属和有机物污染土壤的治理大多采用客土法、石灰改良法、化学试剂淋洗法、焚烧或煅烧的热处理法等物理化学方法(Cunningham et al., 1995;Kham et al., 2000;李天杰, 1995)。这些方法在污染土壤的改良和治理方面虽然具有一定的理论意义,但在实际应用上往往都存在某些局限,不利于大面积推广。严峻的现实促使人们将目光投向投资及运作费用低、易于管理与操作、不产生二次污染和易为大众接受的新型修复技术的研究上来。近年来发展起来的植物修复技术以其安全、廉价的特点正成为研究和开发的热点(Chaney et al., 1997;Salt et al., 1998;骆永明, 1999)。
1 污染土壤植物修复技术植物修复技术(phytoremediation)是以植物忍耐和富集某种或某些有机或无机污染物为理论基础,利用植物或植物与微生物的共生体系清除环境中污染物的一门环境污染治理技术。广义的植物修复技术包括利用植物修复重金属污染的土壤、利用植物净化空气、利用植物清除放射性核素和利用植物及其根系微生物共存体系净化土壤中有机物4个方面(Raskin et al., 1997;Lin et al., 1998;Alkorta et al., 2001;Lasat, 2002;Harvey et al., 2002)。
1983年,Chaney首次提到将超累积植物用于去除受污染土壤中的金属的可能性,1993年McGrath等也提出这一观点(Robinson et al., 1997)。根据其作用过程和机理,重金属污染土壤的植物修复技术可归为以下几种:1)植物固化技术(phytoimmbolization),利用耐重金属植物或超累积植物降低重金属的活性,从而减少金属被淋滤到地下水或通过空气扩散进一步污染环境的可能性。2)植物挥发技术(phytovolatilization), 利用一些植物来促进重金属转变为可挥发的形态,挥发出土壤和植物表面以减少土壤重金属污染。3)植物提取技术(phytoextraction), 利用重金属积累植物或超积累植物将土壤中的重金属萃取出来,富集并搬运到植物根部可吸收部位和植物地上部位,待植物收获后再进行处理。连续种植这种植物,可使土壤中重金属含量降低到可接受水平(Raskin et al., 1997;Lin et al., 1998;Alkorta et al., 2001;沈振国等, 2000)。
根据作用过程和机理,有机物污染土壤的植物修复技术可归为2种类型:1)直接植物修复,有机物污染的直接植物修复类似于重金属污染的植物修复,通过植物对污染物的直接吸收来修复污染土壤,其主要受到目标化合物可利用性及植物摄取机制的限制。2)体外植物修复,体外植物修复一方面是基于植物根系分泌作用,支持根际丰富的微生物多样性及其对污染物的降解活性;另一方面,植物还可分泌多种酶类进入土壤,这些酶类许多能够降解有机污染物(Anderson et al., 1993;Shanks et al., 1999;张太平等, 2003)。
相对而言,植物提取是一种具永久性和广域性于一体的植物修复途径,已被证实为去除环境重金属和有机物污染的重要方法(Edwards et al., 1986;Robinson et al., 1997)。用于植物提取技术的理想植物应具备以下性质:能忍耐高水平的重金属和有机物;在可收获部分能积累高水平的重金属和有机物;生长速率高;在田间的生物量大;具有发达根系组织。到目前为止, 已发现了500多种超累积植物。随着研究的深入,人们发现目前所知的超累积植物一般生物量小,生长速率较慢,而且只对某种污染元素或有机化合物积累或超积累,而现实的环境污染多为复合污染,加之受气候和土壤环境限制,这些超累积植物很难具有实际应用价值。而生长速度快、生物量大的植物往往对污染物忍耐性低,组织中富集量不高。为了解决这个矛盾,使得普通植物具有超累积植物的优良性能,国外已有将基因技术应用于植物修复的研究(Rugh et al., 1996;1998;Sharon et al., 2000;Mejare et al., 2001; Kondo et al., 2002;Erkin et al., 2003; Oscar et al., 2003; Itziar et al., 2004; Wangeline et al., 2004)。
2 污染土壤转基因植物修复 2.1 植物修复基因技术的研究方法在自然生物中, 存在许多具有污染物抗性和富集能力的体系。微生物是获取适于植物修复基因的主要基因源,同时能将重金属含量积累到一定程度的植物也是适于植物修复的基因源。而将目标基因导入其他植物体内是非常复杂的,通常每一种污染物都要求有特定的分子机制进行有效的高富集或产生高抗性,从而使植物适用于污染土壤生物修复技术。获取潜在基因的步骤通常是:首先识别出对特定污染物耐性强或累积性高的生物,通过生物化学、分子生物学等方法鉴别出控制这些性状的基因;然后将这些基因按设计方案定向连接起来,并在特定的受体细胞中,与载体一起得到复制与表达,使受体细胞获得新的遗传特性。最后,要将转基因植物进行田间试验,确定是否达到目的(Kärenlampi et al., 2002;骆永明, 1999)。
2.2 重金属耐性基因及其在清除重金属污染中的应用 2.2.1 MT基因和PC基因在转基因植物清除重金属污染中的应用为人们熟知的金属结合蛋白包括金属硫蛋白、金属活性酶、金属酶、多种金属储藏体、金属载体和蛋白通道。此外,植物螯合肽及由酶聚合反应生成的对迁移性离子具有很强亲和力的低分子量γ-Glu-Cys聚合物广泛分布于酵母和高等植物中(Ilya, 1996)。在众多生物中发现的重金属结合肽(例如MTs)通过半胱氨酸残基上的巯基与重金属结合形成无毒或低毒的络合物,从而清除重金属的毒害作用(张玉秀等, 1999)。金属结合蛋白具有金属特异性,如只隔离毒性金属(如Cd、Hg和Pb等),而不隔离重要的微量元素(如Zn)。在改造能够忍耐和积累重金属的植物时,更多的努力是集中在将那些已知参与哺乳动物解毒作用的MT导入到植物中。表达MT的转基因植物能够增强对Cd2+的耐受性,累积或改变Cd2+的分布。有研究表明,MT表达的转基因植株对Cd2+的耐受性提高,达到200 μmol·L-1 Cd2+(Suh et al., 1998)。另有研究表明,MT表达的植株中只有40%~50%的Cd2+被转运到叶子中,根和茎中的Cd2+却有增加;而对照植株中,70%~80%的Cd2+被转运到叶子中(Misara et al., 1989)。此外表达MT的转基因植株叶肉组织中Cd2+减少了73%,但叶脉中Cd2+含量明显增加(Mejare et al., 2001)。
植物体内植络素(PC)是主要的解毒剂,植络素能与营养元素和有毒金属形成配合物,促进这些元素向液泡中运输。导入了植络素合成酶基因的植物,本身能合成大量的植络素, 增强了植物的抗重金属能力(Richard, 2000)。植物螯合肽对Cu和Cd具有较强的结合能力并且能被多种重金属诱导产生,它在植物的耐Cd中起着重要的作用。Zhu等研究发现Escherichia coli的谷氨酰半胱氨酸合成酶基因(gshⅠ)和谷胱甘肽合成酶基因(gshⅡ)融合体过量表达的印度芥菜(Brassica juncea)转基因植株比对照积累更多的Cd2+(Zhu et al., 1999)。E. coli的gshⅡ在胞质中的过量表达,使茎尖Cd2+的浓度达到25%。每一茎尖总Cd2+累积均比对照高2倍(Howden et al., 1992)。
2.2.2 merA、merB基因和ACC基因在转基因植物清除重金属污染中的应用某些细菌能够还原重金属,减少其毒性。从Gram阴性细菌中分离出来的包括5~6个被操纵子编码的泵离子还原酶基因(merA)可将毒性较强的Hg2+转变为毒性低的金属Hg0,从植物中挥发,也可增强植物对汞的抗性(Rensing et al., 1992),具有此类基因的细菌对Au3+和Ag+也有一定的还原能力(Summer et al., 1974)。研究表明导入merA基因的植株其F2及其后续世代可以在含HgCl2高达25~100 μmol的介质中正常发芽生长,而这一浓度水平对大多数植株是有毒害作用的(Clayton et al., 1996)。Rugh通过修改merA 9%的编码区域构造了一个突变体序列(merA pe9),并将其引入到拟南芥菜(Arabidopsis thaliana),在含有100 μmol Hg的介质中发芽并生长发育;尽管转基因只表达了低水平的merA Mrna,但相对于对照植物体内含有2~3倍的Hg0,而且这种植物对Au3+抗性也得到提高。用基因(merA18)修饰的转基因北美鹅掌楸(Liriodendron tulipifera)其体内的Hg0含量是对照的10倍(Clayton et al., 1996)。merA转基因杨树对汞的修复结果表明,转基因杨树比对照中Hg 0含量高出10倍,植物抗汞能力也提高了3~4倍(Rugh et al., 1998)。导入merA的拟南芥菜籽粒,其幼苗中Hg0含量是对照的2~3倍,对Au3+也产生一定抗性(Rugh et al., 1996)。merB基因即有机汞裂解酶基因,导入了merB基因的拟南芥菜能有效地将甲基汞和其他形式的有机汞转化为无机汞,大大降低了汞的毒性(Rugh et al., 1996)。由此看出,merA和merB基因对汞修复的主要机制是把有毒的Hg2+转化成低毒的Hg0,挥发到大气中,并增强植物抗汞能力,而其对植物吸收、积累汞能力的影响则不太明显。利用基因工程技术将包含mer A和merB基因的操纵子导入目标材料, 结果显示稳定整合merA和merB基因的植物耐受PMA(醋酸苯基汞)的能力大大增强, 其可以在400μmol浓度的PMA介质中生长, 其生物量也是在相同PMA浓度介质中生长的野生型植物的2倍(Oscar et al., 2003)。
研究表明细菌中的1-氨基环丙烷-1-羧酸(ACC)脱氨基酶能将ACC转变为α-丁酮酸盐和氨,降低植物体内乙烯的合成。ACC脱氨基酶基因的表达能促进植物持续生长,从而提高对重金属的吸收,在某些情况下,能提高重金属在茎/叶中的比例。研究结果将细菌中的1-氨基环丙烷-1-羧酸(ACC)脱氨基酶基因引入到番茄(Lycopersicon esculentum)后,分别在启动子35 S(来源于花椰菜同源嵌合体病毒)、rolD(来源于发根农杆菌Agrobacterium rhizogene)和PRB-1b(来源于番茄)的控制下,番茄具有了对Cd、Co、Cu、Ni、Pb和Zn的耐性,且不同程度地提高了这些重金属在植物组织中的富集;尤其是在PRB-1b启动子的控制下,与对照组相比,对Cd、Cu富集能力分别提高了5倍、3倍,在叶子中浓度分别达到35 mg·kg-1、53 mg·kg-1(Varvara et al., 2000)。
2.2.3 FRE基因及其在转基因植物清除重金属污染中的应用通过分子生物学技术导入多种目标基因获得具有能够修复重金属复合污染土壤能力的植物是今后植物修复技术的一个发展方向,相关潜在候选基因的筛选是实现该目标的关键。将铁螯合还原酶基因(FRE)的2种形式FRE1和FRE2同时和分别导入到烟草中,结果发现导入了FRE2和(FRE1+FRE2)的植株比对照和导入了FRE1的植株对Fe具有更高的耐性,幼叶中Fe3+的含量也较高。这些基因还可以改善作物的营养质量,进而增强其长势。由于铁螯合还原酶的存在,使得拟南芥菜中Mn的含量增加了8倍(Delhaize et al., 1994)。此结果表明,在适当启动子的作用下,这种体制可用于生产修复重金属复合污染土壤的植物。
2.3 有机污染物耐性基因及其在植物清除有机污染中的应用相对于污染土壤重金属转基因植物修复研究而言,有机污染土壤转基因植物修复起步较晚,相关研究报道相对较少。植物可以降解和矿化多种多样的复杂有机物,但对植物降解有机物机制的了解远不如对动物和细菌的了解。环境中有机污染物转基因植物修复的靶标物质主要为多氯联苯类化合物(PCBs)、稠环芳烃类化合物(PAHs)、硝基苯环类化合物\线形卤化的碳氢化合物(TE C)等持久性有机污染物(POPs)。此类化合物中的绝大多数不但有毒、致畸而且致癌(Richard,2000)。
在一系列对人类和野生生物具有危害性的环境污染物中,TEC也许是土壤和地下水中分布最广泛的有机污染物,生长在TEC污染区域的植物可以提取、有效转移TEC,通过在植物根系施入有利于生物降解细菌生长的根系分泌物可以加速TEC的降解(Andeson et al., 1993)。精密的对比试验和同位素标记试验证实,在无菌条件下生长的杂交杨树能够有效提取TEC并将其降解为三氯乙烯、氯化醋酸盐以及最终产物CO2(Gordon et al., 1998)。研究表明在无菌转基因杨树组织培养试验中,10 d之内超过10%的TEC可以被降解为CO2(Wackett et al., 1994)。实验室条件下和田间试验条件下研究证实转基因杂交杨树都可以吸收和代谢TEC(Lee et al., 1998)。P450 2E1(CYB 2E1)是一种被广泛研究的具有超强氧化能力的哺乳动物类细胞色素,它能氧化包括诸如TEC、二溴化乙烯(EDB)、苯、苯乙烯、氯仿和乙烯基氯化物等在内的多种化合物(Sharon et al., 2000)。由于其对数种主要的土壤污染物有效,P450 2E1(CYB 2E1)被认为是增强植物有机污染修复效率的候选基因。其他哺乳动物类细胞色素已被成功导入植物体内以增强其耐受除草剂毒害的能力。研究证实将人类P450 2E1导入西红柿能极大提高其对TEC和EDB的代谢能力(Sharon et al., 2000)。
硝基苯环类化合物具有强毒性和致癌作用且不易被矿化。2, 4, 6-三硝基甲苯(TNT)以及一系列的硝基取代物如三次甲基三硝基胺(RDX)及硝酸甘油(GTN)被用于军事工业。它们污染了生产地、储藏地和堆放场所附近的大片土地和河流(Richard, 2000)。不同属的多种植物都表现出降解TNT的能力,然而只有少数几种表现出较高的降解效率(Best et al., 1997;Scheidemann et al., 1998;Peterson et al., 1998)。
经过植物降解,TNT的最终产物为CO2、氨或是硝酸盐。尽管硝基苯环类化合物有多种复杂的降解途径,降解产物中三唑磷胺占主导地位(Hughes et al., 1997)。在一系列转基因技术可以增强植物自然降解硝基苯环类化合物能力的实例中,表达与还原型辅酶Ⅱ(NADPH)结合的细菌磷酸还原酶基因的西红柿能够明显增强植物降解GTN的能力。转基因植株能够耐受GTN和TNT的浓度比野生型植株高10倍。前期研究表明此类转基因植株分解GTN和它的一阶降解产物甘油二硝酸盐的能力比野生植株高2倍(French et al., 1999)。目前还不清楚这些硝基取代物的哪一部分被完全矿化。然而,这种降解能力的增强使利用植物修复有毒硝基苯环类污染物的可能性大为增强。French及其同事通过导入季戊四醇四硝酸脂还原酶成功培育了能够降解硝酸脂和硝基苯环类化合物的转基因植物,其可在含有0.05 mmol·L-1的TNT的环境中正常生长,而0.025 mmol·L-1的TNT却可使野生的烟草致死。基因改良的烟草能够对TNT除氮,生成二硝基和一硝基芳香化合物(Lee et al., 1998)。
PCBs因其剧毒、致癌,分布广泛且不易降解,被认为是最难治理的环境污染物。某些植物的无菌培养试验表明其可以有效降解数类PCBs(Kas et al., 1997; Mackova et al., 1997)。PCBs被植物降解的基本机制还未阐明,研究表明含有高度氯化苯环的PCBs很难被植物和细菌所降解,具有更高PCBs降解效率的植物正处于寻找和发展阶段(Richard, 2000)。研究表明10多种细菌基因能增强降解PCBs的能力,潜在的具有降解PCBs能力的转基因植物将在几年之内出现(Lee et al., 1998)。不列颠哥伦比亚大学的研究者宣称已经发现了阻碍PCBs在自然环境中被微生物降解的关键步骤,通过改造将相关基因导入土壤微生物可以增强微生物降解PCBs的能力,并正在为最终获得具有降解PCBs能力的转基因植物作前期准备工作(Greg,2003)。
3 展望转基因技术的应用为污染土壤的植物修复提供了广阔发展空间。尽管关于转基因作物特别是其基因逃逸风险的争议颇多,但对于用于植物修复的转基因植物,有人认为大多数基因工程植物同那些没有进行基因改造的植物相比,无论是在原始状态,还是受污染状态下,基因逃逸的优势很小或者没有。因此,不必担心转基因超累积植物可能存在的风险。国内对污染土壤的转基因植物修复研究刚刚起步,鲜见这方面的研究报道。因此,在国内开展污染土壤转基因植物修复的机制研究,探索能有效修复重金属和有机污染物污染的环境的植物,是必要的,也是紧迫的。今后应加强以下几方面的工作:1)继续加强对中国特有超积累植物的寻找,并对其超积累机制进行深入研究。以期产生更多的具有独立知识产权的可用于污染土壤修复的转基因植物品种。2)加强对国外相关转基因超积累植物和相关修复技术的引进工作。3)加强污染土壤转基因植物修复技术与传统的化学、物理方法相结合的综合技术的研究。4)加强提高转基因植物生物修复效率的综合技术研究。
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