鼠害作为一种自然生物灾害，其所造成的经济损失和巨大影响波及自然生态系统和社会经济系统两个方面(王祖望等，1996；邓址，1989)。因此，人们迫切希望控制和消灭鼠害。总结人类的灭鼠史，人们对老鼠采取的抵御手段主要有驱避法、械捕法和毒杀法。驱避法和械捕法由于受种种客观条件的限制，不宜于大面积和持久性使用，而采用毒杀法更是弊大于利。鉴于此，从整个大环境来看，使老鼠不育似乎更能达到控制群体数量的目的。Knipling等(1972)用鼠类模型对传统的灭鼠法和不育法进行了比较研究，结果表明使用有效的不育剂比使用传统的毒杀方法更有可能达到目的。

由于目前所使用的化学不育剂、免疫不育剂和雌性激素类药物存在着选择性不强、对环境和非靶生物有危险等弊端，因而这方面的研究虽多，但具体的应用很少。若能将价格低廉、使用方便、用量少、对环境无污染的植物作为一种不育剂用于灭鼠，将有良好的生态效应和社会效益。因此，国家科委将“应用植物不育剂防治多种害鼠技术”的研究列为林业星火计划项目的一部分。目前国内使用不育剂控制鼠类还处于起步阶段。本研究选择印度的传统植物药印楝(Azadirachta indica)种子提取物——印楝油(neem oil)作为节育剂(Mukherjee et al., 1996a；1996b; Juneja et al., 1996; Talwar et al., 1997; Raghuvanshi et al., 2001; Awasthy, 2001)，依据印楝油抗生育活性成分主要存在于低极性和中间极性组分中(Garg et al., 1994; 1998)，研究了其氯仿提取物的抗生育作用，旨在探索出一条控制鼠害的新途径。

1 材料与方法 1.1 材料

印楝油由成都绿金公司惠赠，将印楝油经过低极性溶剂(石油醚)回流提取后的残渣再用中间极性的溶剂(氯仿)回流提取，浓缩后，得到印楝油氯仿提取物。试验动物选用性成熟昆明种小鼠(KM mus musculus)，雄性90只，雌性680只，体重为20~24 g，25~30日龄，常规方式饲养，自由采食。

1.2 方法 1.2.1 毒理试验(詹金彪等，1993)

取健康小白鼠100只，雌(末孕)雄各半，体重20~24 g，随机编号。用灭菌生理盐水配制一系列不同浓度的样品溶液, 各小鼠腹腔内分别注射不同浓度的样品溶液，并逐一记录注射时间。在正常饲养条件下，记录各鼠死亡时间，精确至5 min, 以死亡时间与注射时间两项，求出各鼠的存活时间, 列出各种剂量(D)下小鼠的存活时间(T)，并求出相应的比值剂量/存活时间。根据Molinengo的改进法(Molinengo, 1979)，剂量与剂量/存活时间之间存在线性关系。把剂量与相应的剂量/存活时间各点进行直线回归和统计处理，即可求得LD₅₀值。

1.2.2 临床试验和睾丸组织的流式细胞学研究

选择性成熟雄性昆明种小鼠，随机分成2组，每组20只，试验组口服2 g·kg^-1的印楝油氯仿提取物，用1%羧甲基纤维素(sodium carboxymethylcellulose，CMC)作为混悬剂，空白对照组给予等量的1%羧甲基纤维素(CMC)，每日1次，连续给药1周，造成生精障碍模型，停药后3周(为精子发生的一个周期)，将试验组和对照组雄鼠分别与性成熟的雌鼠按1:2合笼进行交配试验，计算生育率。雄鼠在交配后, 各组处死5只，分别取一侧睾丸称重，另一侧睾丸组织制备睾丸悬液，采用机械方法制备睾丸细胞悬液混合液(10⁶个·mL^-1)，鸡红细胞作为开机后调整流式细胞仪的标准样品，PI染色，测定各种细胞数量和DNA倍体(贾瑞鹏等，1996)。流式细胞仪分析：用Coulter公司生产的EPICS V型流式细胞仪进行分析，仪器的工作条件为激光波长488 nm，接收讯号有FLS和IRFL，讯号以List mode方式贮存，每个样品分析10 000个细胞，用仪器内装的MDADS计算机作结果分析。其余小鼠继续饲养观察，一部分在停药后1~6个月采试验鼠外周血，分离血清，检测以下指标：转氨酶(aminotransferase，ALT)、碱性磷酸酶(alkaline phosphatase，ALP)和γ-谷氨酰转肽酶(γ-glutamyl transpeptidase，GGT)，同时用放射免疫法(RIA)测定血清中睾酮的含量。另一部分每个发情周期后更换雌鼠，持续观察12个月，以此研究药物的远期效应。

1.2.3 对变态期精子细胞核蛋白转换的影响

精子细胞核制备停药后第3周，取附睾，剪碎后加入适量生理盐水，于室温搅拌20 min，用100目尼龙网过滤，滤液离心收集，沉淀为附睾精子。将精子悬于适量水中，超声处理30 s，然后加到盛有1.5 mol·L^-1蔗糖溶液的离心管中，精子悬液在上层，梯度离心，1 000 g× 30 min，沉淀为精子核。总碱性核蛋白的(total alkaline nuclear protein，TNBP)提取和扫描按文献进行(费仁仁等，1994；戴文平等，1994；Fei et al., 1988)。

1.2.4 统计学分析

数据用x±S.D.表示，组间比较用t检验。

2 结果 2.1 毒理试验

按照詹金彪等提供的LD₅₀值的简易测定方法，测出印楝油氯仿提取物的LD₅₀为33 g·kg^-1, 而抗生育剂量为2 g·kg^-1。

2.2 临床试验和睾丸组织流式细胞术研究结果

采用t检验统计数据。结果显示小鼠口服印楝油氯仿提取物后，对睾丸重量无影响，连续观察1年，试验鼠可在1~6个月不孕，7~12个月怀孕率逐渐回升，结果见表 1。小鼠口服印楝油氯仿提取物后血清中转氨酶(ALT、AST)与对照组相比，在停药后3个月显著升高，停药后6个月显著降低(P < 0.01)；碱性磷酸酶(ALP)在停药后3个月，与对照组相比，无显著差异，而在停药后6个月，显著降低(P < 0.01)；γ-谷氨酰转肽酶(GGT)酶在停药后3个月和6个月与对照组相比，无显著差异。血清中睾丸酮的含量在停药后3个月和6个月与对照组相比无显著差异。结果见表 2和表 3。小鼠口服印楝油氯仿提取物后，1C细胞减少，2C细胞相对增多, 对照组G1期细胞百分比为78%，G2期细胞百分比为7.2%，试验组G1期细胞百分比为67.1%，G2期细胞百分比为20.5%。另外，从DNA倍体变化的直方图上可以看出，试验组出现明显的亚二倍体峰(Ap)，凋亡率对照组为20.9%, 试验组为62.4%(见图 1)。

2.3 对变态期精子细胞核蛋白转换的影响

从核中提取总碱性核蛋白，电泳发现，总碱性核蛋白经过药物处理后明显降低，对照组总碱性核蛋白含量占总总碱性核蛋白的42.56%, 试验组占22.51%, 减少的百分率为47.11%。总组蛋白/精核蛋白的比值明显升高，对照组为0.465，而试验组为2.28，升高的百分率为80.25%。

3 讨论

本研究表明，印楝油氯仿提取物具有明显的节育作用，节育效果可达6个月。其半数致死量是抗生育剂量的10多倍，对环境和非靶生物无危险，显示出该药做为节育剂控制鼠害的可行性。

血清中碱性磷酸酶的变化，表明印楝氯仿提取物对小鼠肝细胞有一定的损伤，从而导致细胞内酶的逸出。血清中睾酮含量的变化表明印楝油氯仿提取物尽管具有抗生育作用，但并不影响睾酮转运到曲细精管和血液的能力，即不影响小鼠的交配和性行为，这与其它植物性抗生育剂的作用结果一致(贾瑞鹏等，1996)。

性成熟的小鼠在生精过程中伴随着染色体的分裂，DNA含量也减半，因此流式细胞术直方图上表现为1C、2C、4C 3个峰，小鼠口服印楝油氯仿提取物后，1C细胞减少，2C细胞(主要为非生精细胞)相对增加，说明印楝油氯仿提取物对生精细胞具有明显的抑制作用，同时可刺激非生精细胞，使其合成代谢增加，DNA含量增高，但通过何种方式引起上述改变尚不清楚。Upadhyay等(1993)认为，印楝油可增加巨噬细胞的吞噬活性及MHC-Ⅱ型抗原在巨噬细胞上的表达，同时可产生细胞因子(Cytokines)来干扰附睾、睾丸中正常生精过程所需的免疫产物，从而导致免疫性不育。我们的研究结果表明，睾丸组织2C细胞含量显著增高，也就是说睾丸中巨噬细胞、间质细胞、支持细胞DNA合成活跃，功能增强，特别是巨噬细胞功能增强，可以激活局部免疫反应，这与Upadhyay等(1993)的研究结果相吻合，可见，其抗生育作用与细胞免疫介导有关，然而，这还需要更多的证据来证实这个观点。

精子发生由精原细胞，经精母细胞减数分裂后，进入精子细胞变态阶段，这阶段精子细胞形态由圆形变为长形，核高度浓缩，伴随这些形态学的改变，核内组蛋白逐渐被精核蛋白取代，形成精子特异染色质。小鼠口服印楝油氯仿提取物后，睾丸内精子细胞核蛋白取代过程受阻，进而导致附睾精子核蛋白组型异常使精子不能充分分化成熟，这可能是印楝油氯仿提取物导致不育的重要原因。精核蛋白与生育力有着密切的关系，是精子发生过程中敏感而薄弱的环节，对这方面的深入研究，将使我们对节育剂的认识提高到新的高度。