林业科学  2005, Vol. 41 Issue (4): 118-122   PDF    
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赵同海, 徐静, 徐红梅, 张青文, 陈京元.
Zhao Tonghai, Xu Jing, Xu Hongmei, Zhang Qingwen, Chen Jingyuan.
松叶面抗虫共生工程菌的构建
Construction of A Pine Needle Symbiotic Engineered Bacterium Exhibiting the Insecticidal Activity to Dendrolimus punctatus
林业科学, 2005, 41(4): 118-122.
Scientia Silvae Sinicae, 2005, 41(4): 118-122.

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收稿日期:2003-09-18

作者相关文章

赵同海
徐静
徐红梅
张青文
陈京元

松叶面抗虫共生工程菌的构建
赵同海1, 徐静2, 徐红梅3, 张青文2, 陈京元3     
1. 中国林业科学研究院森林生态环境与保护研究所 北京 100091;
2. 中国农业大学昆虫学系 北京 100094;
3. 湖北省林业科学研究院森林保护研究所 武汉 430079
摘要: 将来自Bacillus thuringiensis subsp. kurstaki的杀虫基因cryIAc通过综合质粒载体pEG601, 整合到松树共生细菌B. cereus(Bc752)的染色体上,得到的工程菌对马尾松毛虫幼虫有明显的杀虫活性。此综合质粒含有能在营养期表达Bt cryIAc基因的强启动子、cryIAc杀虫基因、四环素抗性标记基因tetr、8.0 kb的EcoRI-NcoB.cereus(O147)染色体片段。将综合质粒通过电击导入Bc752中,综合质粒与Bc752染色体发生同源重组,将Bt cryIAc基因整合到Bc752的染色体上。通过对转化子的DNA酶切分析、PCR扩增、SDS-PAGE凝胶电泳检测、Western blot、电镜观察、毒力测定,结果表明Bt cryIAc基因已经整合到松树共生细菌Bc752的染色体上,并可高效表达。
关键词: 苏云金芽孢杆菌    杀虫蛋白    松叶面共生菌    工程菌    马尾松毛虫    
Construction of A Pine Needle Symbiotic Engineered Bacterium Exhibiting the Insecticidal Activity to Dendrolimus punctatus
Zhao Tonghai1, Xu Jing2, Xu Hongmei3, Zhang Qingwen2, Chen Jingyuan3     
1. Institute of Forest Ecology, Environment and Protection, CAF Beijing 100091;
2. Department of Entomology, China Agricultural University Beijing 10094;
3. Institute of Forest Protection, Hubei Academy of Forestry Wuhan 430079
Abstract: Bt cryIAc gene from Bacillus thuringiensis subsp. kurstaki was introduced into the chromosome of pine symbiotic bacterium Bacillus cereus (Bc752) by an integrative vector pEG601. The vector contains a strong vegetative promoter, the cryIAc gene (identified as a 7.4 kb SphI-NruI fragment of DNA from B. thuringiensis HD-73), the tetracycline resistance gene (tetr) and an 8.0 kb EcoRI-NcoI fragment of chromosomal DNA from Bc752 to allow for homologous recombinant between the vector and the bacterial chromosome. Transformation of Bc752 with plasmid pEG601 by electroporation resulted in the engineered symbiotic bacteria. Insertion of the vector DNA into the chromosome was demonstrated by analysis of DNA restriction enzymes and PCR amplification. Recombination strains containing Bt cryIAc gene produced the 133ku protoxin which could be detected by SDS-PAGE, ELISA, electronmicroscope observation and insect bioassays.
Key words: Bacillus thuringiensis(Bt)    insecticidal protein    pine needle symbiotic bacteria    engineered bacterium    Dendrolimus punctatus    

松毛虫(Dendrolimus)是危害松树的重要害虫,也是我国历史性的森林大害虫,每年发生面积达150多万hm2,造成巨大的经济损失和环境影响。苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis,Bt)是目前害虫生物防治、植物抗虫育种和杀虫工程微生物构建中研究较为深入,应用较为广泛的一类微生物,其杀虫剂已广泛应用于农业、林业和卫生害虫的生物防治(陈昌洁,1990)。Bt杀虫剂也广泛用于松毛虫的生物防治,但是Bt杀虫剂在实际使用中存在的无残留属性要求人们必须经常性地使用,才能持续地控制害虫的发生(蒲蛰龙,1992)。

将Bt杀虫基因通过基因重组技术构建成工程微生物,可提高杀虫晶体蛋白的产量、扩大杀虫谱、延长持效期,从而扩大Bt的使用范围。Obukwicz(1986)将Bt杀虫基因转入了在玉米(Zea mays)根际定植的荧光假单孢菌Pseudomonas fluorescens体内,可以控制地下害虫的危害。Turner等(1991)Lampel等(1994)利用同源重组技术,将Bt杀虫基因转入在玉米维管束定植的内生细菌Clavibacter xyli subsp.cynodontis体内,利用工程菌CXC/Bt防治钻蛀性害虫欧洲玉米螟(Ostrinia nubilalis),可减少危害60%。Selinger等(1998)将Bt kurstaki杀虫基因导入根围定居菌Bacillus pumitus体内,用于防治地下害虫西方灰地老虎(Agrotis orthogonia)。赵同海等(1996)徐静等(2002)将Bt cryIAc杀虫基因转入棉花(Gossypium hirsutum)内生细菌,构建的重组工程菌对棉铃虫(Heliothis armige ra)等棉花的鳞翅目害虫具有较高的杀虫活性。Tang Wei等(2003)将人工合成的Bt cryIAc基因转化火炬松(Pinus taeda)成熟的胚状体, 得到的转基因植株对马尾松毛虫(Dendrolimus punctatus)和台湾大蓑蛾(Cryptothelea formosicola)具有明显的抗虫效果。

胡炳福(19882000)对从松树针叶表面分离得到的两株优势共生细菌(Pseudomonas 175和B. cereus 752,Bc752)进行了研究,结果显示,两株细菌引入松林生态系统后能迅速占领植物表面,形成优势菌群(或“隔离墙”),抑制病原菌和其他有害菌,调节植物的微生物环境,促进植物生长,具有防病促生的作用。本研究采用同源重组的方法,将Bt cryIAc杀虫基因导入Bc752菌株的染色体上,构建松针叶面抗虫共生工程细菌,使二者的特点结合起来,达到持续控制松毛虫的目的。

1 材料和方法 1.1 材料

供试菌株:松叶面共生菌Bc752(抗硫酸链霉素突变株)由湖北省林科院胡炳福提供;抗虫蛋白基因cry1 Ac供体菌EG7315(Bc569-6含质粒pEG501)与Bt菌野生菌株HD-73(含cry1 Ac目的基因)由中国农业大学张青文提供。

1.2 方法 1.2.1 综合质粒pEG601的构建

提取含营养期表达Bt cryIAc基因的质粒pEG501和宿主菌Bc752染色体DNA,分别用Eco RI-NcoI酶切,回收的质粒大片段和来自Bc752的3.5kb的插入片段,用T4 DNA连接酶连接,形成综合质粒pEG601。连接反应采用《分子克隆》的常规方法进行。

1.2.2 综合质粒pEG601向松针叶面共生细菌Bc752中的转化

Bc752感受态细胞的制备依Brian等(1989)的方法进行,转化采用电转化法,并辅以CaCl2感受态转化法作为对照。

1.2.3 转化子DNA的SphI-NruI酶切检测

取转化子DNA溶液18 μL与2 μL的10×限制酶缓冲液混匀,加入1~2 U的限制酶混匀,37℃下温育1~1.5 h,加入0.5 mol·L-1 EDTA(pH 8.0)使终浓度达10 mmol·L-1终止反应。酶切产物通过0.7%的琼脂糖凝胶电泳检测。

1.2.4 PCR扩增检测转化子

1) 引物的设计参照Sue等(1993)方法进行,cryI特异性引物的序列分别为:Primer 1:5′-TCACTTCCCATCGACATCTACC;Primer 2:5′-ATCACTGAGTCGCTTCGCATGTTTGACTTTCTC。

2) PCR扩增:PCR反应体系建立后,摸索其循环参数为:94 ℃变性1 min,55 ℃退火1 min,72 ℃延伸1 min,30次循环,采用热启动。

3) PCR产物的回收、纯化与检测:PCR产物的纯化与回收采用Promega公司WizardTM PCR Products Purification System进行,PCR产物的检测采用2% TAE琼脂糖凝胶电泳检测。

1.2.5 SDS-PAGE

凝胶电泳检测分离胶浓度为5%,具体步骤见文献(奥斯伯等,1998),经染色、脱色后,凝胶拍照显示结果。从未染色的凝胶中回收毒蛋白作为抗原注射接种兔。

1.2.6 抗原的纯化及免疫接种

采用Sephades G-75(Pharmacia公司)凝胶过滤分离纯化抗原,用缓冲液PBS(pH7.2)洗脱,流速为1 mL·min-1,收集第一峰,免疫接种委托中国农业科学院原子能研究所进行。

1.2.7 抗血清的纯化

用硫酸铵沉淀IgG,具体方法见文献(奥斯伯等,1998)。

1.2.8 ELISA检测

参照Takahashi等(1998)方法,采用双抗夹心ELISA法检测CryIAc毒蛋白抗原,步骤见文献(奥斯伯等,1998)。

1.2.9 电镜观察

李荣森等(1992)方法进行,取对数生长中期和芽孢形成期的工程菌培养液经洗涤离心后,用于制备透射电镜观察的样品。

1.2.10 毒力测定

将充分活化的工程菌株,按体积分数10%接种量转接于LB液体培养基中, 28 ℃, 200 r·min-1振荡培养至孢子囊破裂,芽孢和伴孢晶体释放出来。将此菌液喷洒松针至滴水为度,晾干后饲喂2龄马尾松毛虫幼虫。6 d后统计死亡率。

2 结果和分析 2.1 转化子DNA的SphI和NruI酶切分析

在目的基因Bt cryIAc片段的两端分别存在有SphI和NruI酶切位点,由这两种酶切割的cryIAc基因片段长度约为7.4 kb。cryIAc基因供体菌EG7315和转化子的DNA经SphI-NruI酶切后均出现7.4 kb条带,而未经转化的受体菌Bc752的DNA则无此带,这表明cryIAc基因已经整合到Bc752的染色体上(如图 1所示)。

图 1 转化子DNA SphI-NruI酶切图 Fig. 1 Analysis of SphI-NruI framents from transformants a: λDNA/Hind Ⅲ marker; b, d:转化子SH-1 Transformant SH-1; c:转化子SH-2 Transformant SH-2; e:EG7315; f: Bc752
2.2 PCR扩增检测

用自行设计的cryIAc特异性引物Primer1、Primer2, 在适宜条件下,分别以转化子DNA、综合质粒pEG601、未经转化的Bc752 DNA为模板,扩增结果如图 2所示:结果显示转化子DNA、综合质粒pEG601、HD-73的质粒DNA和对照DNA均能扩增出长约0.5 kb的cryIAc目的片段,而未经转化的受体菌Bc752则无此条带,表明转化子DNA中有cryIAc基因存在。

图 2 转化子DNA PCR扩增图 Fig. 2 PCR analysis of cryIAc gene a: Bc752; b:毒蛋白Ac型基因cryIAc gene; c.转化子SH-1 Transformant SH-1; f: HD-73; d:转化子SH-2 transformant SH-2; e: PBR322/MspI marker; g: EG7315; h: pEG601
2.3 SDS-PAGE凝胶电泳

用SDS-PAGE凝胶电泳检测转化子cryIAc基因的表达与否,结果如图 3所示:Bt CryIAc毒蛋白约为133 ku,与对照未转化受体菌Bc752相比,转化子与Bt野生菌株均有133 ku的条带出现,这表明转化子均表达了Bt CryIAc毒蛋白。

图 3 SDS-PAGE凝胶电泳检测CryIAc毒蛋白 Fig. 3 SDS-polyacrylamide gel electropherogram a: HD-73; b:蛋白质分子量标准Protein molecular weight marker;c,e,g:转化子SH-2 Transformant SH-2;d,f,h:转化子SH-1 Transformant SH-1;j: Bc752
2.4 ELISA检测结果

对抗血清进行ELISA效价检测表明,10万倍稀释时抗血清与阴性血清反应的OD值比仍然大于2.1倍(见表 1),因此认为制备抗血清最高有效稀释度应为10万倍以上。而以不同稀释度抗血清对转化子SH-1、SH-2及阴性对照Bc752(未经转化的受体菌)和阳性对照Bt CryIAc毒蛋白进行检测结果表明;两个转化子与抗血清的反应均为阳性(见表 1)。由此可知2个转化子均表达了Bt CryIAc毒蛋白,其中SH-1表达量较高。

表 1 抗Bt cryIAc毒蛋白抗血清的ELISA效价及其与cryIAc的交叉反应 Tab.1 The titers of anti cryIAc antiserum and cross reactivities of cryIAc
2.5 电镜观察结果 2.5.1 转化子芽孢形成期毒素

蛋白晶体的透射电镜观察结果如图 4,由于Bt cryIAc毒蛋白具有一定的结构,一般为菱形的伴孢晶体,可电镜观察转化子有无伴孢晶体。从图 4可见转化子SH-1在芽孢期形成菱形伴孢晶体,表明转化子在芽孢期能够大量表达Bt cryIAc毒蛋白。

图 4 转化子SH-1芽孢期透射电镜观察结果(12 450×) Fig. 4 Morphology of parasporal crystals during sporulation of SH-1 in an scanning transmission electron microscope (12 450×) C:伴孢晶体Crystal; S:芽孢Spore; 下同The same below.
2.5.2 转化子营养生长期菌体的透射电镜观察

结果如图 5,从图可以看出,转化子SH-1在营养生长期能产生伴孢晶体蛋白。这说明插入到Bc752菌株染色体的B t CryIAc毒素蛋白基因, 不仅可在其本身携带的依赖于芽孢形成因子的启动子下表达形成伴孢晶体, 也可以在四环素抗性基因的营养期表达启动子下表达产生毒素晶体蛋白,而且在双启动子下毒素蛋白的表达量更多,伴孢晶体也较大。

图 5 转化子SH-1营养期透射电镜观察结果(49 500×) Fig. 5 Morphology of parasporal crystals during the vegetative growth of SH-1 in an scanning transmission electron microscope (49 500×)
2.6 毒力测定

cryIAc基因工程菌SH-1、Bt野生菌株HD-73和受体菌Bc752培养液对马尾松毛虫二龄幼虫(每个处理试虫数均为60只)6 d的生测结果,三者的校正死亡率分别为86.19%、8 2.24%和68.44%,对照为工程菌的毒力高于Bt野生菌株HD-73,三者的毒力大小依次为SH-1>HD-73>Bc752。

3 讨论

植物微生态学研究表明, 在植物体内外广泛存在着大量的非病原性微生物类群, 其中芽孢杆菌属的细菌占居着优势地位, 而蜡质芽孢杆菌(Bacillus cereus)更是其中的最优势者(梅汝鸿,1991)。蜡质芽孢杆菌与苏云金芽孢杆菌之间具有极大的相似性, 在表型鉴定上除不能形成伴孢晶体外几乎没有什么不同,遗传杂交也表明它们在遗传上具有极大的同源性(Priest, 1981)。Gonzalez等(1982)Schurter (1989)的研究说明, 苏云金芽孢杆菌δ-内毒素蛋白基因可以在蜡质芽孢杆菌中正常地表达,并形成同样形态的伴孢晶体。本研究结果也证实,通过同源重组插入到松树针叶共生菌Bc752菌株染色体上的Bt毒蛋白基因cryIAc可以正常表达,形成菱形伴孢晶体,并保持其良好的抗虫生物活性。Bt毒蛋白基因cryIAc在蜡质芽孢杆菌细胞内可以正常表达并具有形成伴孢晶体的能力,这一点为筛选鉴定转化子带来了极大的便利,通过镜检伴孢晶体即可判断转化是否成功,可以免除了一般基因转化研究所必须进行的繁杂的Northern Blot或Western Blot步骤。

苏云金芽孢杆菌δ-内毒素蛋白的表达受发育调控, 它只有在静止期才产生芽孢和伴孢晶体。在没有形成芽孢的环境条件或芽孢形成突变株中, 不产生毒素蛋白(Mettus et al., 1990)。有关植物内生菌的研究指出, 植物内生性微生物由于其和植物共同进化, 在植物体内暂时或永久性地丧失了产孢的能力(White et al., 1985)。本研究所用的转Bt素蛋白基因的宿主菌Bc752菌株为松树叶表共生菌,其在松树叶表共生繁殖是否保持形成芽孢的能力目前还未见到研究报道。但本研究利用Bc752所构建的工程菌,其δ-内毒素抗虫基因携带有来自蜡质芽孢杆菌pBC16质粒的可在营养期高效率表达的启动子,被引入到松树生态系统后,在增殖生长的同时,即使不形成芽孢,也可以产生毒素蛋白,发挥抗虫效果。

B. cereus 752菌株是从马尾松针叶表面分离得到的优势共生细菌,胡炳福(2000)的研究表明,Bc752菌能够产生赤霉素(GA3)、吲哚乙酸(IAA)等促生物质和几丁质酶、卵磷脂酶C等抑菌物质,对林木(或苗木)直接起到促生和抗病作用。卵磷脂酶C同时也是昆虫的α-外毒素,当昆虫的中肠不呈碱性时,它可帮助细菌侵入血腔,破坏肠道,使害虫致死,所以Bc752菌本身对马尾松毛虫幼虫也有一定的控制效果。本研究的生测试验也得到了同样的结果,但对马尾松毛虫的抗虫效果不如Bt毒蛋白基因供体菌株HD-73,工程菌株SH-1对马尾松毛虫的毒力效果比Bc752和HD-73都高,可能是它结合了两者优势的缘故。限于条件,本研究没能对工程菌株的LC50进行测定,这部分工作以及工程菌株对松毛虫的持续控制效果都有待于进一步的研究。

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