氮是植物所需要的大量营养元素之一，比其他任何一种营养元素更能限制植物的生产力(Vitousek et al., 1991; Cassman et al., 1993; Crawford et al., 1998)。在北方森林生态系统中，虽然有些森林植物能利用有机氮(Näsholm et al., 1998)，但对无机氮(硝酸盐和可交换的铵)的吸收利用更普遍，因为树木具有完善的无机氮吸收与同化机制(Martins-Louçõo et al., 2000)。在世界范围内，土壤中对植物和微生物有效的无机氮占总氮约1%或更少(Foth et al., 1997)。植物和微生物能很快消耗掉这些有效氮。另外，硝酸盐容易淋溶，这使得本来就少的有效氮更少。在自然状态下，陆地生态系统中土壤有效氮来源于岩石的风化、固氮菌的作用、有机质的分解以及大气氮素的沉降(Chapin III et al., 2002)。在森林生态系统中，虽然有时大气氮素沉降在有些地区较高(Mitchell et al., 1997; Ohrui et al., 1997)，对森林树木的生长、光合作用以及营养状态产生影响(Nakaji et al., 2001)，但在绝大多数森林中，土壤有效氮的补充仍主要来源于有机质的矿化(Chapin III et al., 2002)。在我国东北林区，温度是影响有机质矿化进程的最主要因子(张彦东等，1999)。因长达半年之久的冬季，有机质矿化过程缓慢，森林土壤有效氮素得不到及时补充，土壤有效氮素含量低，因此，东北林区主要工业用材树木常常缺乏氮素营养(张彦东等，1999)。氮素缺乏对植物的生长发育以及光合作用的影响已有相当多的报道，但对叶绿素生物合成的影响研究很少。

磷也是植物所需要的重要大量元素。虽然磷在地壳中非常丰富，但能为植物利用的有效磷非常少。在土壤溶液中，磷浓度仅仅为0~8 μmol·L^-1。即使向土壤中施加磷肥，绝大部分亦为土壤所固定(Barrow，1980；Holford，1997；Marschner, 1995)。且磷在土壤中的扩散速度非常缓慢(Smith et al., 2003)，比硝酸盐的扩散速度低几个数量级，这样在植物根际很容易形成一个磷的耗竭带(depletion zone)(Poirier et al., 2002)。因此，植物也经常处于磷胁迫的环境中。在磷胁迫下，植物的光合作用(Lewis et al., 1994; Warren et al., 2002a)、生长(de Groot et al., 2001)以及生物量分配(吴楚等，2004)受到影响。

长白落叶松(Larix olgensis)是我国东北林区最重要的工业用材树种之一，氮磷养分的缺乏限制了其生产力的提高。本文研究了氮磷养分对长白落叶松叶绿素的生物合成、叶片氮含量和光合作用等方面的影响，为更好地培育落叶松人工林提供理论基础。

随机挑选地径和高度一致的长白落叶松1年生幼苗，于5月20日移植到塑料桶(直径30 cm，高27 cm)中。桶中事先装有河沙(用稀盐酸浸泡、水冲洗)。每桶4棵幼苗。幼苗供给如下全营养液：NH₄NO₃，8 mmol·L^-1；KH₂PO₄, 1 mmol·L^-1; KCl, 1 mmol·L^-1; CaCl₂·6H₂O, 1 mmol·L^-1; MgSO₄·7H₂O, 0.6 mmol· L^-1; FeCl₃·6H₂O, 0.02 mmol· L^-1; MnCl₂·4H₂O, 6 μmol·L^-1; H₃BO₃, 0.016 mmol·L^-1 ; ZnCl₂, 0.3 μmol·L^-1; CuCl₂·2H₂O, 0.3 μmol·L^-1; NaMoO₄·2H₂O, 0.3 μmol·L^-1。必要时用Ca(OH)₂或H₂ SO₄把pH值调整到5.5~6.0。培养1个月后，进行NH₄NO₃浓度梯度处理：1.0、2.0、4.0、8.0、16.0 mmol·L^-1(其中8 mmol·L^-1为对照，作为正常供N水平)。同时另一些苗木进行KH₂PO₄浓度梯度处理：0.125、0.25、0.5、1.0、2 mmol·L^-1 (其中1 mmol·L^-1为对照)。在进行NH₄NO₃和KH₂PO₄浓度处理时，其他营养成分浓度不变。每个浓度处理10盆。每个处理每2 d浇1次营养液(每盆每次浇100 mL)，在8:00—9:00进行。每天8:00—9: 00和17:00—18:00分2次浇水，每次每盆约200 mL。温室内昼夜温度分别为30 ℃和18 ℃，相对湿度80%以上，光照平均14 h·d^-1。于8月8日活体测定和取样。

叶绿素含量以二甲基甲酰胺为提取液，离心后进行比色分析，按Wellburn (1994)的方法计算。5-氨基酮戊酸(ALA)合成速率和胆色原素(PBG)合成酶活性根据吴楚等(2003)的方法。叶片中N含量以凯氏定氮仪测定(Horneck et al., 1998)。可溶性蛋白质含量根据Bradford (1976)的方法测定。

气体交换活体测定在9:00—11:00进行，用光合作用系统CI-301PS(CID公司，USA)测定，同时使用FMS荧光仪(Hansatech Instruments Ltd, UK)进行叶绿素荧光参数的测定(吴楚等，2004)。测定条件：温度为33~36 ℃, PPFD为1 800 μmol·m^-2s^-1，相对湿度为55%~65%。气体交换测定后，用刀把所测定的叶片切下，用于ALA合成速率和可溶性蛋白含量以及叶绿素含量等的分析；另外一些材料经过液氮处理后储存在-80 ℃，用于酶活性分析；或在80 ℃烘干保存，用于叶片总氮分析。

所有实验室内的化学分析均重复3次，所有活体测定重复10次。所有统计分析采用SPSS软件包(v.10.0，SPSS Inc, Chicago, Illinois, USA)。

在硝酸盐浓度处理下，随着硝酸盐浓度从1 mmol·L^-1增加到8 mmol·L^-1，ALA合成速率增加；而当硝酸盐浓度达到16 mmol·L^-1时，ALA合成速率反而下降17%(图 1A)，但不显著(P>0.05, LSD)。在磷酸盐处理下，ALA合成速率变化与之相似(图 1B)。当磷供给达到2 mmol·L^-1时，ALA合成速率下降，但不显著(P >0.05, LSD)。在硝酸盐和磷酸盐处理下，虽然PBG合成酶活性变化不规则，但在ALA合成速率达到最大时(硝酸盐和磷酸盐浓度分别为8和2 mmol·L^-1)，PBG合成酶活性也达到最大(图 1)。当硝酸盐浓度达到16 mmol·L^-1时，PBG合成酶活性下降17%(图 1C)，但下降不显著(P>0.05, LSD)。当磷酸盐浓度达到2 mmol·L^-1，PBG合成酶活性下降16%(图 1D)，但没有显著差异(P>0.05, LSD)。

图 1 不同浓度的氮磷处理对长白落叶松幼苗叶片中ALA合成速率和PBG合成酶活性的影响 Fig. 1 Effects of different nitrogen and phosphorus concentration treatment on biosynthesis rates of ALA (A and B) and activity of PBG synthase (C and D) in leaves of L.olgensis seedlings (mean±SD, n=3)

叶绿素a、叶绿素b、总叶绿素以及类胡萝卜素含量均在硝酸铵浓度为8 mmol·L^-1时达到最大，但叶绿素a/b在硝酸铵浓度为4 mmol·L^-1时为最大(表 1)。当幼苗进行磷处理时，叶绿素a、叶绿素b、总叶绿素以及类胡萝卜素含量都在磷浓度为1 mmol ·L^-1时达到最大，而叶绿素a/b在磷浓度为0.5 mmol·L^-1时最大(表 1)。

表 1 不同浓度的氮磷处理对长白落叶松幼苗叶绿素和类胡萝卜素含量的影响^① Tab.1 Contents of chlorophyll and cartenoids in leaves of L.olgensis seedlings supplied with different concentrations of nitrate or phosphate

表 1 不同浓度的氮磷处理对长白落叶松幼苗叶绿素和类胡萝卜素含量的影响① Tab.1 Contents of chlorophyll and cartenoids in leaves of L.olgensis seedlings supplied with different concentrations of nitrate or phosphate

在硝酸盐处理下，叶片总氮含量随硝酸铵浓度增加而增加，在硝酸盐浓度为16 mmol·L^-1时叶片总氮含量达到18.9 mg·g^-1DW(图 2A)。在磷酸盐处理下，当磷酸盐浓度从0.125增加到1 mmol·L^-1时叶片总氮含量只有微量增加，且磷酸盐浓度达到2 mmol·L^-1时叶片总氮含量反而下降9%(图 2B)。在硝酸盐处理下，随硝酸盐浓度从1增加到8 mmol·L^-1，叶片中可溶性蛋白含量总体上逐渐增加，但硝酸盐浓度达到16 mmol·L ^-1时，可溶性蛋白含量下降17%(图 2C)。在磷酸盐浓度处理下，可溶性蛋白含量在0.25 mmol·L ^-1时达到最大，随后逐渐减少(图 2D)。

图 2 不同浓度的氮磷处理对长白落叶松幼苗叶片中氮含量和可溶性蛋白含量的影响 Fig. 2 Effects of different nitrogen and phosphorus concentration treatment on total nitrogen content (A and B) and soluble protein content (C and D) in leaves of L.olgensis seedlings (mean±SD, n=3)

F_v/F_m为PSⅡ的最大光量子产量，是表示PSⅡ内在效率的指标(即PSⅡ中心全部开放时的量子效率)(Maxwell et al., 2000)。在硝酸盐处理下，F_v/F_m总体上随硝酸盐浓度从1 mmol·L^-1增加到8 mmol·L^-1而逐渐增加，而在16 mmol·L^-1时反而下降(图 3A)。在磷酸盐处理下，F_v/F_m的变化趋势与硝酸盐处理下的变化相似(图 3B)。在硝酸盐处理下，当硝酸盐浓度从1 mmol·L^-1增加到8 mmol·L^-1时，长白落叶松幼苗净光合速率逐渐增大，但当硝酸盐浓度增加到16 mmol·L^-1时净光合速率反而下降16%(图 3C)。在磷酸盐处理下，净光合速率在1 mmol·L^-1时最大；当磷酸盐浓度为2 mmol·L^-1时光合速率下降到最低(0.04 μmol·g^-1DW)(图 3D)：表明磷酸盐浓度过高会引起光合速率下降。

图 3 不同浓度的氮磷处理对长白落叶松幼苗叶片荧光参数和光合速率的影响 Fig. 3 Effects of different nitrogen and phosphorus concentration treatment on a fluorescent parameter (A and B) and photosynthetic rates (C and D) in leaves of L.olgensis seedlings (mean±SD, n=10)

氮磷是树木生长所需要的2种大量营养元素，其供给水平直接影响树木的生长和发育的许多生理过程，尤其是光合作用。光合作用的第1步就是光能的捕捉，这个过程是由光合色素(主要是叶绿素a、叶绿素b、类胡萝卜素)来完成的。因此，光合色素的生物合成对于光能捕捉和光合作用是非常重要的。在叶绿素的生物合成过程中，ALA是公认的叶绿素生物合成的第1个重要前体，而PBG合成酶则是催化ALA向PBG转化的重要酶(Smith et al., 1993; Malkin et al., 2000)，因此，ALA的合成速率和PBG合成酶的活性会影响叶绿素的合成(Masuda et al., 1996)。当长白落叶松幼苗硝酸铵供给浓度为8 mmol·L^-1时，叶绿素a、叶绿素b、总叶绿素以及类胡萝卜素含量均达到最大，过量(16 mmol·L^-1)则使之下降(表 1)；而在8 mmol·L^-1供给水平下，ALA合成速率(图 1A)和PBG合成酶活性(图 1C)达到最大，在16 mmol·L^-1供给水平下则下降；由此可以看出，ALA合成速率和PBG合成酶活性对叶绿素a和b以及类胡萝卜素的含量产生直接影响。在线性系列反应过程中，关键酶的活性对产物的含量具有很强限制作用(Small et al., 1993a)，因此，本试验结果符合流动控制理论(Small et al., 1993a；1993b)。在磷处理下，尽管当磷浓度为1 mmol ·L^-1时ALA合成速率和PBG合成酶活性达到最大，但它们并没有使叶绿素a和b、总叶绿素以及类胡萝卜素含量达到最大，这表明磷供给水平对叶绿素生物合成的影响并不像氮供给那样大。

在硝酸铵处理下，叶片总氮含量随氮供给水平的增加而增加(图 2A)，而叶片可溶性蛋白含量只在8 mmol·L^-1氮时达到最大(图 2C)，这表明在供给幼苗16 mmol·L^-1氮时，叶片中总氮向可溶性蛋白的分配并没有达到最大。这种分配直接影响了光合速率(图 3C)，因为在光合作用过程中最关键酶Rubisco的含量占叶片可溶性蛋白含量的比例大(Makino et al., 1983; Wittenbach, 1979; Lauerer et al, 1993; Bhagwat, 2002)。在磷处理下，幼苗叶片中总氮含量在1 mmol·L^-1最大(图 2B)，而相应的可溶性蛋白含量则较低(图 2D)，这表明在此磷浓度下，叶片中总氮向可溶性蛋白的分配量并不大。然而，在此磷浓度下净光合速率最大，则表明尽管此时可溶性蛋白含量不高，但因磷能影响氮向Rubisco的分配(Warren et al., 2002b)，可以推测在1 mmol·L^-1浓度下，Rubisco占可溶性蛋白的比例达到最大，从而使光合作用的羧化速率达到最大。

在硝酸盐处理下，其供给水平对长白落叶松幼苗叶绿素生物合成过程中ALA合成速率和PBG酶活性影响较大，从而影响叶片中叶绿素和类胡萝卜素含量；同时氮供给水平也影响叶片总氮和可溶性蛋白含量，因而影响净光合速率。在磷处理下，其供给水平对长白落叶松幼苗叶绿素的生物合成过程中ALA合成速率和PBG酶活性影响较大，但对幼苗叶片中叶绿素和类胡萝卜素含量影响则小，同时对光合速率的影响也小。