枣是我国特产，种植普遍。枣疯病是枣树(Ziziphus jujuba)上一种毁灭性植原体(phytoplasmas)病害。在我国25个省(市)均有不同程度的发生，造成了巨大的经济损失，严重阻碍了枣树产业的发展(温秀军等，2001; 田国忠，2001; 田国忠等，2002)。北京的密云和河北的玉田等县的小枣，由于枣疯病危害基本绝产，河北太行山区的唐县、阜平、曲阳3县每年因枣疯病毁树20余万株。鉴于枣树的经济价值和枣疯病危害的严重性，多年来，人们一直在试图寻找有效的防治方法，如加强枣园管理，环剥、截枝，四环素类树干输液，药杀传播昆虫，选育抗病品种，培育脱毒苗等，其中，选用抗病品种是目前解决这类维管束系统侵染性病害防治的一种根本途径。苹果(Malus pumila)、核桃(Juglans regia)、桑树(Morus alba)、泡桐(Paulownia spp.)、枣树等皆存在许多抗病品种资源，并且某些抗病品种或品系也在生产上发挥了一定的防病作用¹⁾ (朱风平等，1994；Carraro et al., 1998；田国忠等，1994; 1999；2002；温秀军等，2001；吴朝吉等，1992；徐亚明等，1994)。由于植原体尚不能离体人工培养，且对植原体与寄主相互作用的研究又相对薄弱，因而对抗病种质资源的抗性鉴定及抗病机制的研究也相对滞后，影响了抗病品种选育及进一步通过基因工程途径培育抗病品种的进程。本研究在过去工作的基础上(温秀军等，2001)，对选择的具有抗病表现的枣树品种和单株做了进一步的田间抗病测定和PCR检测鉴定，并针对与抗病有关的酚类物质做了薄层层析分析，对筛选出的抗病品种的抗病机制进行了初步探讨，旨在选育出高抗枣疯病枣树品种，进行繁殖和推广，促进枣树生产的健康发展。

1) 金红.1990.枣疯病丛枝症状形成的生理病理学基础.中国农业科学院研究生院硕士论文

2) 田国忠. 1999.泡桐丛枝病植原体与泡桐的生化和分子互作研究.中国农业大学植保学院博士论文

1 材料与方法 1.1 试验地点、供试枣树品种与传病方法

试验地位于河北省保定市唐县军城镇枣树集中栽培中心区，面积400 m²。品种有壶瓶枣、蛤蟆枣、马牙枣、长红枣、砘子枣、婆枣6个品种和1个酸枣品种以及从婆枣中选择的46个抗病单株，其中婆枣和酸枣采自唐县军城镇，均为根蘖苗，其余是以当地酸枣为砧木的嫁接苗，接穗来自山西果树研究所中国枣树基因库，46个抗病单株为分别依据不同标准选定的婆枣单株(温秀军等，2001)，分布于太行山区7县，此次采集其根蘖苗，定植于试验地中，供抗病测定之用。病原接种采用嫁接病皮和病枝2种方法，病皮和病枝采自当地表现典型丛枝症状的婆枣，病皮用皮接法嫁接，6—8月在备测的苗木上接病皮2~5块，每株接1~4块，每块面积约1 cm²；病枝采用劈接法，于春季4月下旬枣树发芽前进行，每株接1 ~5个病枝。在1996年7—8月、1997年6—7月；2001年6—7月分别进行了病皮传病，1998、2 000和2001年每年4月进行病枝传病，共进行了6次病原嫁接接种。

1.2 植原体的PCR检测

称取定量的枣树鲜材料或干材料用液氮研磨粉碎，用100 g·L^-1SDS、蛋白酶K、CTAB、酚/氯仿-氯仿异戊醇抽提和纯化植物和植原体总DNA，55 ℃温浴后离去沉淀，用异丙醇沉淀DNA，再用TE悬浮DNA后置于冰箱-20 ℃下保存备用。

以植原体16rRNA基因保守序列设计引物对R16mF2/R2和R16F2/R2进行直接PCR和Neste d-PCR²⁾(田国忠等，2002)。直接PCR反应体系为5 μL，模板DNA 1 μL，10倍的PCR缓冲液5 μL，2.5 mmol·L^-1dNTP 4 μL，引物(R16mF2/R16mR2)2 μL，重蒸水37 μL，Ta qDNA酶1 μL(5 U·μL)，上覆盖30~50 μL矿物油，扩增条件为94 ℃，45 s；52 ℃，90 s；72 ℃，60 s。扩增35个循环，然后72 ℃，保育10 min。Nested-CR为直接PCR产物稀释40倍后取1 μL作模板，引物为R16F2/R2，其他条件同直接PCR。扩增产物用1%琼脂糖凝胶电泳，然后于紫外灯下检查有无1.5 kb(直接PCR产物)和1.2 kb(Nested-PCR产物)的特异扩增片段。

1.3 DAPI荧光显微镜观察

对备测的枣树新鲜材料做徒手切片(横、纵)，体积分数5%的戊二醛固定，0.1 mol·L ^-1的磷酸缓冲液(pH7.0)冲洗，加DAPI染料染色，然后于Olympus荧光显微镜上观察，激发滤光片波长为365 nm，阻断滤光片波长为420 nm。自发荧光是指把切片经戊二醛固定后不用DAPI染料染色，直接在荧光显微镜上观察²⁾(田国忠，1990；田国忠等，2002)。

1.4 酚类物质的提取及薄层层析分析

称取定量的新鲜茎叶于研钵中，加一定体积的无水甲醇研磨，定容，冰箱内4 ℃下抽提(2 h以上)后，12 000 r·m^-1离心20 min，收集上清液甲醇相，沉淀继续加甲醇溶解抽提，将甲醇相合并，直至沉淀变白为止。将所收集的上清液通入氮气流吹除甲醇，所留体积为原来的1/2~1/3左右(可在60 ℃水浴中吹)，向剩余的上清液中加2倍体积的石油醚萃取2~3次(上层为石油醚相，下层为甲醇相)，再用氮气流将甲醇相吹干，用少量甲醇(含BHT抗氧化剂)将甲醇相吹干残留物溶解并转移到离心管中，于冰箱内-20 ℃下保存，以备测用。

薄层层析采用硅胶板为固定相，分别用异丙醇:氨水:水(8:1:1)和正丁醇:乙酸:水(4:1:5)2种展层流动相进行层析，然后在紫外光下进行荧光鉴定和FeCl₃显色(Canal et al., 1981; Harborne et al., 1989; Candela et al., 1995; Campos-Vargas et al., 2002; 张立名等，1991；周顺伍，1991)。

2 结果与分析 2.1 供试枣树和酸枣的田间抗病测定结果

1995年春季将备测枣树苗木统一定植于试验地中，养护1年，1996年7月开始嫁接病皮和病枝，进行病原接种，观测各品种和单株的抗病性，抗病测定方法、时间、数量和逐年调查结果见表 1。7年观测结果证明，不同品种和选择的单株间抗病性存在明显差异，壶瓶枣和蛤蟆枣经过2000和2001年2次嫁接病枝和1996、1997和2001年3次嫁接病皮共5次传病，到2002年底供试枣苗中没有1株发病，对枣疯病表现出了很强的抗性，而砘子枣和婆枣经过1996和1997年2次嫁接病皮后即很快发病，1997年发病率在80%以上，1998年则达到1 00%，说明其对枣疯病十分敏感。长红枣、马牙枣和酸枣对枣疯病也表现出了较高的敏感性。

选择的46个抗病婆枣单株经过3次传病后的平均发病率为78.4%，但不同单株间抗病表现明显差异，其中26个单株在1996年第1次接病皮的第2年(1997年)即全部或大部分发病；13个单株经过2~3次传病后于1998或1999年发病；有2个单株在经过3次传病后表现正常(1996、1997年2次嫁接病皮和1998年嫁接病枝)，但在2000、2001嫁接病枝和2001年嫁接病皮后，于2002年5月发病；有5个单株经过5年6次传病，到2002年底仍表现正常，这个结果说明此5个单株对枣疯病表现出了很强的抗性。在5个表现抗病的单株中，1个单株1998年嫁接病枝曾萌发出新病枝，但1999年病枝全部死亡，到2002年底，又经过3次传病，一直表现正常，其他4个单株嫁接的病枝在萌发新枝时，则均发出正常枝条，没有任何病状出现(表 2)。

2.2 枣疯病植原体PCR检测结果

为了解应用嫁接病皮和病枝方法进行枣疯病病原传病的有效性以及传病后枣疯病植原体在枣树体内的浓度变化，2001年4—9月和2002年4—9月，对具有不同抗病和感病表现的枣树和酸枣共计22株枣树29个部位上(包括病接穗)的232个新鲜茎叶样品进行了PCR检测(约每隔1个月检测1次)，测定其中植原体有无及浓度高低。供检测的样品基本情况见表 3，PCR测定结果见表 4。

经过多次传病后，JL8和JL9在2002年开始表现病状，其他5个抗病单株仍然表现健康。在2001年5、6、7、8月对表现具有很高抗性的婆枣单株JL系列(JL8H、JL9H、JL1D、JL2H除外)、壶瓶枣Hu系列以及蛤蟆枣Ha1H、Ha2H的健枝进行的PCR检测中，PCR扩增只有Hu 4H在7月检测为阳性，Nested-PCR扩增也只有JL10-1H在8月、JL10-3H在5月、JLl5H在5月和Hu4H在5、7月检测为阳性，其余均呈现阴性；而在2002年的4、6、7、9月同样的的检测中，Nested-PCR扩增除JL24H在4月、Hu4H、Hu5H和HalH在7月检测为阴性，其余均呈现阳性，PCR扩增检测也多为阳性，如JLl0-3H在4月、JL1 2-2H、Hu1H、Hu2H、Hu4H、Hu5H在6月、Hu1H、Hu4H在7月、Hu1H、Hu2H、Hu4H、Hu5H、Hu6H在9月(这种现象抗病壶瓶枣出现居多)。另外，对用于病原接种的10组病枝样品和作为对照的感病材料当地普通婆枣、马芽枣和酸枣进行了PCR检测，婆枣疯枝(JL1)、酸枣疯枝(SuanD)2次检测均为阳性；婆枣健枝(JL2H)和酸枣健枝(SuanH)在第2次扩增(Nested-PCR)中也都检测为阳性，用于病原接种的10组病枝样品也均呈现阳性(图 1)。

以上结果说明应用病枝和病皮嫁接方法进行枣疯病植原体病原接种是可行的，在病原接种后的抗病和感病苗木中均检测到植原体存在。在抗病苗木JL10-1、JL10-2、JL12-1、JL12 -2、JL15、JL19和JL24中，进行直接PCR均没有检测出植原体存在，需要进行Nest-PCR才能检测到，而在同时接种的感病材料中，不仅外观表现病状，而且直接PCR即可看到显著的阳性反应，这说明接种到抗病材料中的枣疯病植原体不能像其在感病材料中那样迅速繁殖，因此浓度很低。对于田间表现抗病的Hu系列(Hu1—Hu6)，在进行病原接种后，虽然田间表现正常，没有长出病枝，但进行PCR检测证明在其体内枣疯病植原体浓度相对JL系列和Ha系列较高，这似乎表现出其对枣疯病的一种耐病作用。相反，JL系列和Ha系列表现出抑制植原体在其体内强烈繁殖的抗病作用；而通过直接PCR和Nested-PCR检测出在JL15、JL19和Ha1、Ha2中时为阳性，时为阴性的现象，这可能由其抗病作用造成其体内植原体不均匀分布，出现阴性的结果恰好赶上所取的样品没有植原体定植所致。表现健康的酸枣健枝(SuanH)，进行检测后也表现为阳性，证明其体内已感染植原体，可能是田间的一种无症带菌现象的表现。

2.3 不同枣树品种和单株DAPI荧光显微镜检测及自发荧光观察结果

PCR检测结果不符，可能是嫁接传病后由于其有一定的抗病性，造成体内植原体分布不均，所检测材料恰好不同的结果。2001年7月对选择JL系列9株、Hu系列3株、Ha系列4株的观测中，所接的病枝长出的枝上，Hu系列中1株观测到有明显的特异性荧光，1株没观测到，1株是不能确定，Ha系列中1株未检测，另3株没观测到荧光；JL系列中，JL9D、JL12-1D、JL12-2D、JL15D没观测到荧光，JL8D、JL10-3D、JL24D是模棱两可，不能确定，其余2株JL10-1D、JL10-2D未观测；砧木接病枝旁取的健枝上，Hu系列1株没有发现荧光，另2株不能确定；Ha系列中1株没有发现荧光，1株是不能确定，另2株是未观测；JL系列中JL9H未观测，JL24H不能确定外，其余7株均为观测到荧光。这(指JL系列)与后来的直接PCR和Nested-PCR均未扩增出植原体DNA特异性带基本符合。

在2002年9月对JL10-1H、JL24H、Hu1D、Hu1H、Ha1H和SuanD的检测中，Hu1D和Suan D(图 2A，B)有明显的荧光带，JL10-1H(图 2C)、JL24H、Hu1H、Ha1H没有荧光带。在JL10-1H(图 2D)、JL24H(图 2E)、Hu1H等抗病材料的切片中发现大量团状的金黄色自发荧光(染色前、后均能看到)，而在HulD和SuanD(图 2F)等感病材料中没有发现或数量很少，其中，JL10-1H、JL24H是选择的抗病婆枣单株，Hu1H是抗病品种壶瓶枣，Hu1D是感病品种婆枣的病接穗嫁接在壶瓶枣Hu1上成活后长出的疯枝，SuanD是感病的酸枣品种。

2.4 酚类物质的薄层层析分析结果

本试验选用了JL10-1H、JL10-2H、JL24H、Hu1D、Hu1H、JL1D、JL2H、SuanD、SuanH、Hu6H共2个枣树品种和1个酸枣品种9株枣苗的10个样品进行了酚类物质的提取和TLC分析, 供试样品的基本情况见表 3。

通过层析分析发现在异丙醇相中，在7月和9月采集的JL10-2H、JL24H、Hu1H、JL2H、H u6H材料中均发现有浅兰色荧光带，其R_f值为0.50左右，其中以7月采集的Hu6H材料最明显，其中JL10-2、JL24为婆枣抗病单株，Hu1、Hu6为壶瓶枣单株，JL2为普通婆枣健树。在正丁醇相中，7月采集的10个样品中只有SuanD样品中出现了很强的R_f值约0.18的荧光点，其他样品只有很淡的荧光出现或没有荧光。在9月采集的样品中，除仍在发病的酸枣疯枝SuanD样品中R_f值约0.18的位置出现了很强的荧光点，在抗病婆枣单株JL10-1H和JL24H样品中没有出现荧光点外，在JL10-2H中出现了很弱的荧光点，在病材料Hu1D中出现了2个荧光点，R_f值分别为0.12和0.20，普通婆枣病材料在R_f值0.17位置上出现了荧光点，在抗病的壶瓶枣2个材料Hu1、Hu6中也发现了荧光点，R_f值约为0.15(图 5)。以上初步分析结果表明，选择的JL系列(婆枣)抗病单株在某些酚类物质代谢方面与抗病的Hu系列(壶瓶枣)存在差异，两者在酚类物质的含量和成分上均与感病材料有显著差异。

3 结论与讨论

通过嫁接病枝和病皮的方法进行6次传病和连续7年观测表明，大部分感病品种的枣苗在经过1次嫁接病皮传病后，第2年即表现出了典型的丛枝症状，少数在第3年发病，第3年不发病的，以后如果不再进行新的病原接种，则不会再发病。而选择的抗病单株和抗病品种经过6次传病和连续7年观测，虽然经PCR扩增检测到了其体内植原体的存在，但浓度很低(多数只能在N-PCR检测到)，抗病品种和单株苗木一直保持正常生长，这个结果说明植原体在抗病品种和单株中的繁殖受到抑制，不能象其在感病枣树中那样迅速增殖，导致植株发病，证明所选的抗病材料具有较为稳定的抗病性。对抗病材料与感病材料体内酚类物质进行的初步分析结果表明，选择的JL系列(婆枣)抗病单株在酚类物质代谢方面与抗病的Hu系列(壶瓶枣)存在差异，两者在酚类物质的含量和成分上均与感病材料有显著差异。通过DAPI荧光显微镜观测发现，抗病材料中金黄色自发荧光物质含量远高于感病材料，但这种自发荧光与薄层层析时出现的荧光斑点之间的关系尚不明确。

从本次试验结果来看，PCR技术比过去常用的DAPI荧光显微镜技术在检测枣疯病植原体的灵敏度明显提高，特别是Nested-PCR，能够从DAPI荧光显微镜和直接PCR不能检测到的嫁接接种植原体后一直未表现丛枝症状的抗病枣树中检测到低浓度的植原体存在，因而在抗病品种鉴定和抗病机制研究上具有更重要的应用价值。这一结果可以说明以下2方面的问题：其一，在被嫁接接种后未表现典型丛枝症状的正常抗病组织内已存在植原体病原，说明病原已通过嫁接病枝和病皮的韧皮部连接成功地进入待鉴定的抗病材料内，即嫁接接种传病方法是可靠的，成功的；其二，病原进入抗病枣树品种组织内，虽然未被杀灭或排除体外，但与感病品种相比，病原的繁殖和扩展速度似乎受到强烈的抑制，而且这种抗病反应可能与枣树体内固有的或嫁接接种植原体后诱导寄主产生的抗病物质的积累有密不可分的联系。而从对病原抑制程度来看抗病婆枣系列及蛤蟆枣似乎比壶瓶枣系列要更强些。

关于植原体与植物的互作机制特别是植物的抗病机制问题，仍是植原体病害研究领域的焦点问题，涉及到生理生化变化、代谢途径改变及激素水平的影响等复杂过程¹⁾(雷国新等，1995；田国忠等，1996；宋淑梅等，2000)，作为一种定居在寄主筛管内的原核病原物，寄主的抗病机制可能涉及过敏性坏死反应、植保素合成、活性氧暴发、酚类物质代谢等方面(董汉松，1996；蔡新忠等，1999；Gerard et al., 1991；Nicholsn et al., 1992; Smith, 1996)。本研究对与抗病材料体内存在的某些荧光物质积累的初步分析可能暗示其在抗病过程中的某些作用，对这类物质的抗菌活性进一步鉴定以及过氧化物酶、多酚氧化酶、苯丙氨酸裂解酶等活性变化及诱导基因表达的研究工作尚在进行之中。

1) 田国忠. 1999.泡桐丛枝病植原体与泡桐的生化和分子互作研究.中国农业大学植保学院博士论文