银杏(Ginkgo biloba)素有裸子植物“活化石”之称，在植物学上具有重要的研究价值；同时银杏的经济价值也很高，既可作为园林绿化树种，也是优良用材树种，且其种子、叶片富含营养与药用成分，用途广泛。然而银杏是雌雄异株植物，实生苗定植后一般需要20~30 a才能开花结果、分出雌雄，常规育种时间长、效率低。栽培过程中结实晚，早期收益低。因此应用生物技术改良品种和进行优良品种的快繁，前景都十分广阔。20世纪30年代以来，银杏组织培养主要以胚(Li，1934)、配子体(Tulecke，1957；Rohr，1980)及营养器官(罗紫娟，1985)为材料，对胚胎学、形态发生及离体培养等进行研究，但由于银杏离体培养分化特别困难，均未得到丛生芽和胚状体；直到90年代，才相继采用不同的外植体，如花粉(Laurain et al., 1993a)、雌配子体(Laurain et al., 1993b)、未成熟胚(Laurain et al., 1996)、成熟胚(吴元立等，1998)，成功地诱导出胚状体，但是这些胚状体最多也只是生长到显微结构上的子叶期，最长不过1 mm，便不再生长，褐化死亡。本研究从银杏未成熟胚的胚轴和子叶中得到胚状体，并获得完整植株。

1 材料与方法 1.1 材料

佛手银杏种子：9月中旬(未成熟胚)和10月下旬(成熟胚)采集于浙江大学华家池校区果园内。

1.2 方法

愈伤组织和胚状体的诱导：取银杏种子, 的乙醇浸泡约30 s后，0.1%的HgCl₂浸泡8~10 min，无菌水冲洗3~5次，用无菌滤纸吸去种子表面水份，在操净台中取出胚，切除胚根，将胚轴和子叶分开，分别接种于附加了不同激素的诱导培养基上，2次重复，诱导愈伤组织和胚状体发生。接种后20 d统计胚轴和子叶的愈伤组织诱导率(表 1)，50 d统计胚状体的诱导情况(表 2)。诱导胚状体的多少用每克愈伤组织所含的胚状体数来表示。

将诱导出胚状体的愈伤组织在无菌条件下取出，剥离胚状体，接种于分别含有不同浓度的活性炭(0，2，3，4 g·L^-1)、蔗糖(0，10，30，40，50 g·L^-1)和椰汁(0，10%，20%，30%)的MS、MK(即改良MS培养基，是MS培养基组分中MgSO₄·7H₂O改为3.7 g·L^-1, KH₂PO₄改为1.7 g·L^-1，其他同MS)、MS + IBA 0.5 mg·L^-1培养基上，研究其对胚状体成苗的影响。

1.3 培养条件

培养温度(25±2) ℃，光照强度2 000 lx，光照时间16 h·d^-1。基本培养基为MS、White、MK，用0.1 mol·L^-1 HCl或1 mol·L^-1 NaOH调节pH值，在灭菌前各基本培养基pH值为5.8，无特殊说明的，培养基中的蔗糖浓度均为30 g·L^-1，琼脂为8 g·L^-1，121 ℃灭菌15 min。

2 结果与分析 2.1 银杏胚轴、子叶愈伤组织诱导

由表 1可知：相同条件下, 银杏未成熟胚胚轴和子叶愈伤组织诱导率差别不大，成熟胚子叶比胚轴更易产生愈伤组织，未成熟胚的子叶和胚轴愈伤组织诱导率都好于成熟胚。但无论成熟胚还是未成熟胚，胚轴产生的愈伤组织(图版Ⅰ-1)质量较好, 质地细腻、均匀一致；而子叶产生的愈伤组织质量较差, 不均匀, 尤其部分成熟胚子叶只表面愈伤化, 伸长较快, 生长一段时间后，愈伤组织易开裂。试验发现, 把长度为3 mm以上的子叶切割开培养, 较整个培养, 诱导愈伤组织的效果好, 可能是培养基和子叶的接触面积加大, 增加了培养基和激素对子叶的作用。3种基本培养基中，White培养基诱导愈伤组织的效果都比较差, 在MS培养基中附加激素NAA(0.5~1.5 mg·L^-1)和6-BA 1 mg·L^-1有利于愈伤组织的诱导, 而2, 4-D 1 mg·L^-1和KT 1 mg·L^-1不利于愈伤组织的形成。无论胚成熟与否，MS培养基和MK培养基都能很好地诱导子叶和胚轴愈伤组织的发生。

2.2 胚轴、子叶胚状体的诱导

愈伤组织产生后，部分愈伤组织可分化产生胚状体，其中有8种培养基可产生胚状体(表 2)，而且只有未成熟胚的胚轴和子叶能分化胚状体，成熟胚的胚轴和子叶均不能分化。未成熟胚胚轴胚状体分化效果好于子叶，在MK + NAA 1 mg·L^-1 + 6-BA 1 mg·L^-1培养基上分化率最高，分化率为45.28%(图版Ⅰ-4，5)，每克愈伤组织最多可产生胚状体32.5个，平均达18.33个。子叶在MK + NAA 1.5 mg·L^-1 + 6-BA 1 mg·L^-1培养基上分化率最高，分化率为12.9%(图版Ⅰ-2，3)，每克愈伤组织最多可产生胚状体15.83个，平均9.17个。从激素水平来说，与诱导愈伤组织的效果相似，以NAA和6-BA配比为最佳，既有利于愈伤组织的形成，也有利于进一步分化胚状体; 而KT和2, 4-D不能诱导胚状体的发生。相对MS培养基来说，MK培养基更有利于胚轴和子叶胚状体的发生。

2.3 活性炭、蔗糖、椰汁对胚状体成苗的影响

胚状体在MS、MK、MS + IBA 0.5 mg·L^-1培养基上不能生长, 褐化死亡。当活性炭增加到3 g·L^-1时，胚状体在MS + IBA 0.5 mg·L^-1培养基上稍有生长，但也褐化死亡，而在MK培养基上则生长发育较好，有10%胚状体生长成苗(图版Ⅰ-7)，说明添加活性炭3 g·L^-1有利于胚状体的生长发育。

蔗糖对胚状体生长发育也有一定影响，在蔗糖浓度为10 g·L^-1的条件下，胚状体在各培养基上，不再生长，而且很快变黄、死亡，可能蔗糖的浓度太低，不能为胚状体的生长提供足够的营养。而随着蔗糖浓度的升高，胚状体推迟变黄，当浓度为40 g·L^-1时，MK培养基上有19.23%胚状体生长成苗(图版Ⅰ-8)。但蔗糖浓度升至50 g·L^-1时，胚状体又不能继续生长发育，说明MK培养基为基本培养基较好，胚状体最适的蔗糖浓度为40 g·L^-1，过高过低都不利于胚状体的生长发育。胚状体成苗率低，也许是其他条件还不适宜胚状体的生长发育所致。

添加不同浓度的椰汁于MS、MS + IBA 0.5 mg·L^-1培养基上，虽然都能使胚状体稍有生长，但不久都褐化死亡。在MK培养基中添加椰汁，胚状体的发育明显得到改善，在添加10%椰汁的培养基上，有34.48%胚状体生长成苗(图版Ⅰ-9)，当浓度升高到20%时，有6.9%的胚状体发育成苗，当浓度再升高，胚状体虽然稍有生长，但不久褐化死亡。说明在MK培养基上添加10%椰汁对胚状体生长发育的促进效果最好，浓度太高不利于胚状体继续发育成苗，也说明MK培养基有利于胚状体成苗。

3 结论与讨论

未成熟胚处于植株的发育早期，脱分化后容易再分化，是组织培养中常用的外植体。有人认为被子植物(Vasil，1987)和裸子植物(Attree et al., 1993)未成熟胚诱导胚状体发生优于成熟胚，许多难分化的作物诱导分化获得成功，大部分先是以未成熟胚为外植体获得的。本试验采用佛手银杏成熟胚和未成熟胚的胚轴、子叶为外植体，结果只有未成熟胚胚轴、子叶能够诱导出胚状体，也说明了未成熟胚分化能力强于成熟胚。

MK培养基较MS培养基更易于形成胚状体，这可能由于MK培养基提供了更适合胚状体形成的营养条件。从外植体来看，未成熟胚的子叶、胚轴都能诱导出胚状体，子叶最大诱导率为12.9%，培养基为MK + NAA 1.5 mg·L^-1 + 6-BA 1 mg·L^-1；胚轴最大诱导率为45.28%，培养基为MK + NAA 1 mg·L^-1 + 6-BA 1 mg·L^-1。胚轴比子叶更易于分化胚状体。

由于选材和其他因素的影响，胚状体生长能力较差，许多情况下不能进一步生长发育(Liu et al., 1990)。银杏胚状体进一步发育也出现了类似的问题。本试验发现分别在MK培养基中附加适量的活性炭、蔗糖、椰汁处理胚状体，都能在不同程度上促进胚状体发育成苗。王伏雄等(1965)认为椰汁对银杏未成熟胚的生长发育有促进作用。本试验通过附加10%椰汁，胚状体的生长发育较好，34.48%的胚状体发育成苗，也进一步说明了椰汁有利于银杏胚状体生长发育。