杨树是我国东北、华北、西北广泛栽种的主要速生造林树种之一。近年来，随着杨树人工造林面积的不断扩大，杨树的虫害问题越来越突出。由于害虫危害，大量的杨树生长不良，丧失绿化、美化和防护效果，甚至大面积死亡。有些地区因害虫危害，不得不成片砍伐销毁，以防治害虫扩散；一些受害虫危害严重的杨树种，不得不淘汰。因此，培育抗虫杨树新品种已成为当务之急的重要任务。通过转基因技术培育抗虫新品种是目前解决杨树虫害问题的最佳方法和有效途径。转抗虫基因杨树的应用与传统害虫防治方法相比，具有安全有效，降低投资和减少环境污染等诸多优点(谢先芝，1999；李志兰等，2002)。

自1987年首次报道了转抗虫基因植物以来，国内外对苏云金芽孢杆菌(Bt)杀虫蛋白基因研究很多，已获得一些转Bt基因的农作物，并已商品化生产。在培育转基因抗虫林木方面，国内外已有在杨树[欧洲黑杨(Populus nigra), 欧美杨(P.×euramericana), 毛白杨(P. tomentosa), 欧美山杨(P. tremula × P. tremuloides), 银白杨×大齿杨(P. alba×P. grandidentata)]、落叶松(Larix gmelinii)、白云杉(Picea asperata)、枫香(Liquidambar formosana)树转入抗虫基因的报道, 特别是杨树转基因研究取得了较大进展(李志兰等，2002；Karl et al., 1995；Klopeensten et al., 1991；1993；McCown et al., 1991)。我国于1993年报道了欧洲黑杨转BtCry1Ac基因研究，获得的抗虫无性系对舞毒蛾(Lymantria dispar)和杨尺蠖(Apocheima cinerarius)毒杀死亡率可达80%~90%(陈颖等，1995；李明亮等，2000)，其它抗虫基因对杨树的转化也取得了较大进展(郝贵霞等，1999；2000；饶红宇等，2000)。经过近10 a的研究，我们将部分改造的Bt Cry1Ac基因与慈菇蛋白酶抑制剂基因构建的双抗虫基因表达载体，通过农杆菌介导法转化了优良白杨杂种741杨，并获得了一批对多种鳞翅目害虫具有高抗虫性的无性系，其中3个高抗无性系具有高的害虫杀死率和对存活害虫发育抑制(田颖川等，2000；郑均宝等，2000)。目前转双抗虫基因741杨已获得林业生物基因工程安全委员会批准的商品化许可证书。为科学地介绍这一转基因杨树，促进其在生产上的推广应用，本文报道了转双抗虫基因741杨基本生物学特性，为转基因杨树在生产中应用提供理论依据。

1 材料和方法 1.1 试验材料

试验材料为白杨杂种741杨及转双抗虫基因741杨。741杨是于1974年开始采用有性杂交获得杂种，经过选育获得的白杨杂种无性系，杂交组合为{银白杨(P.alba)×[山杨(P.davidiana)+小叶杨(P.simonni)]} ×毛白杨(P.tomentosa)。转双抗虫基因741杨是将构件在一个载体上的Bt毒蛋白基因及慈菇蛋白酶抑制剂基因(BtCry1Ac和API-A)采用农杆菌介导法转化受体741杨，经过PCR和Sothern-blot等分子生物学检测和饲虫试验，获得的对鳞翅目害虫具抗虫性的转基因株系。

1.2 研究方法 1.2.1 受体741杨生长特性分析

分别于1981年和1984年在河北易县西陵建立2片741杨无性系对比试验林。以易县毛白杨和生产上常用的其他毛白杨为对照，随机区组，4次重复，4株小区，株行距5 m×6 m。于1990年和2002年分别调查树高、胸径和材积，考察无性系生长表现。

1.2.2 木材特性分析

试验材料取自7年生741杨、毛白杨雄株及北京杨(P.×Beijingensis)对比试验林。随机伐取毛白杨、741杨、北京杨各5株作样木，齐地伐倒后，取每一株的1.3~3.0 m处的木段进行木材物理、力学性质的测定与分析。测定了木材含水率、密度、干缩率、纤维特性及抗弯强度等木材物理力学指标，在每株样木上均匀采取各项样品4~5个，样品测定按国家标准进行，于2002年在河北农业大学木材学实验室测定。

1.2.3 结实特性分析

以对比栽植的7年生741杨和易县毛白杨雌株为观测对象，随机选取10~15株树木为观测株，每株选取3~5个枝条为标准枝，室内水培与室外观察相结合，测定果穗长度、果穗粗度、每穗蒴果数、每米枝条果穗数、蒴果开裂前果穗脱落数，考察741杨和易县毛白杨结实情况。

1.2.3 室内饲虫试验

以苗圃中生长的转基因741杨和未转基因741杨为材料，选取当年生枝条新鲜叶片在室内饲养昆虫。饲养的害虫种类为杨扇舟蛾(Clostera anachoreta)、舞毒蛾、美国白蛾(Hyphantria cunea)、杨小舟蛾(Micromelalopha troglodyta)等。饲养容器为高6 cm直径12 cm的罐头瓶，用所料薄膜扎紧瓶口，细针扎孔通气。选取孵化1~2天的一龄幼虫开始饲养，每瓶至少30头幼虫，重复3次，每天更换新鲜叶片，直到结茧为止。隔日观察一次，记载昆虫死亡数，定期称取虫体重等。

1.2.4 741杨适应性分析

以741杨和白杨杂种无性系303、106及对照易县毛白杨为材料，1982—1985年在河北省内易县、阜城、正定、迁西、涿鹿设置无性系对比试验林。完全随机区组设计，4次重复，3~5株小区，株行距5 m×6 m。用一年生带根苗定植，田间管理措施一致，每株实测树高及胸径，并计算单株材积。单株材积按《全国阔叶树通用二元立木材积表》求得。根据5个试验点6年生生长数据，对无性系在不同环境下的稳定性进行评估。稳定性分析模型根据Ebehart等(1966)提出的公式。

1.2.5 转基因741杨遗传变异性分析

以17个转基因741杨株系为材料，测定了谷氨酸脱氢酶等11种等位酶，实验主要采用水平切片淀粉凝胶电泳分离酶。测定方法参照Hertel等(1999)的方法进行。对上述17个转基因株系叶片提取DNA，采用10对随机引物进行RAPD分析。

2 结果与分析 2.1 转基因受体741杨经济性状表现 2.1.1 生长特性

表 1结果表明，741杨和易县毛白杨相比，在高生长上优势不明显，略优于易县毛白杨，而在胸径生长上显著超出易县毛白杨。22年生时，平均胸径达到43.1 cm，超出易县毛白杨29%。由于胸径的生长优势，材积生长量在22年生时超出对照69%。从表 1还可以看出，随着年龄的增加，741杨的生长优势更加明显，胸径生长量在10年生时超出易县毛白杨18%，到22年生时超出29%。

对比结果表明(表 2)，741杨均显著优于其他毛白杨，这种优势主要来自于胸径和材积，而且随着树龄的增加，741杨胸径生长优势更加明显。

2.1.2 木材特性

从表 3可以看出，741杨在木材密度、纤维特性及抗弯曲强度、顺纹抗拉强度、顺纹抗压强度、顺纹抗劈力、冲击韧性等木材物理力学指标均不同程度优于对照毛白杨和北京杨。经方差分析检测，大部分指标达到显著差异水平。由于741杨木材密度较大，在体积干缩率上高于毛白杨和北京杨，但从弦向与径向比值来看，三个树种之间并未达到显著差异。

2.1.3 结实特性

毛白杨雌株结实量大，种子成熟后蒴果开裂，释放大量絮状物，造成环境污染。随着毛白杨栽植数量的增多，飞絮现象已经成为重要的环境问题，引起社会重视。从转基因树木生物安全角度考虑，雌性植株产生种子，存在外源基因漂流隐患，因此对转基因741杨结实特性进行研究，是十分必要的。通过对741杨和易县毛白杨成熟大树连续3年结实特性调查结果表明(表 4)，741杨在果穗长度、果穗粗度、每个穗蒴果数均显著低于对照易县毛白杨，果穗数量约为毛白杨的60%。通过果穗解剖观察发现，在受精后约2~3周，幼胚逐渐消失，到成熟时已没有种子。由于741杨高度不育，果穗在成熟开裂前70%~90%脱落，因此不会造成明显的飞絮现象。

2.2 转双抗虫基因741杨抗虫性表现 2.2.1 对害虫的致死效应

应用群体饲虫方法，用不同转基因杨株系及对照的叶片饲养目的昆虫，以饲养末期昆虫的总死亡数占饲养初期昆虫数的百分率为昆虫总死亡率，并以此评价转基因杨株系的抗虫性。从约60个转基因株系中筛选出7个株系，用危害杨树的主要食叶害虫进行饲虫试验，结果列于表 5。

由表 5可见，各转基因杨株系表现出不同杀虫效果。测试的3个株系No.3、No.29、No.11表现出较高的杀虫效果，对杨扇舟蛾、美国白蛾、舞毒蛾和杨小舟蛾的幼虫总死亡率达到83%~100%。另外4个株系No.1、No.12、No.9、No.10、No.17，杀虫效果较差，对杨扇舟蛾、美国白蛾和舞毒蛾的幼虫杀死率在30%~75%之间, 仅对杨小舟蛾表现出较高的杀虫效果。说明外源基因在不同无性系中插入的位置不同，毒蛋白的表达量也不相同。在叶片饲虫筛选中，只有约5%~10%的转基因无性系能表现出较强的杀虫效果，大部分转入基因的毒蛋白表达量较低或处于沉默状态，杀虫效果不明显。

2.2.2 抗虫稳定性

用3个高抗株系对杨扇舟蛾和舞毒蛾连续4年饲虫试验结果表明(表 6)，3个转基因无性系对两种害虫的杀虫效果存在一定变化，对杨扇舟蛾的害虫死亡率变动在76.7%~99.9%，对舞毒蛾的幼虫死亡率变动在60.6%~94.5%之间。各无性系杀虫效果在不同年份存在一定差异，如在1999年No.29号和No.11号对舞毒蛾的杀虫效果略差，而在1999年和2000年No.29对杨扇舟蛾的杀虫效果表现不理想。但是，随着年代的推移，各无性系均未表现出有规律下降的趋势，表明转基因植株具有稳定的抗虫性。

2.2.3 对害虫发育的影响

经过转基因植株叶片饲养后的幸存者，其生长发育受到极大影响(图 1)。随着时间的增长，用转基因杨树叶片饲养的害虫和正常饲养的害虫体重增长差距越来越大。杨扇舟蛾在发育到14 d时，转基因叶片饲养的害虫体重仅为0.162~0.185 g，而对照为0.468 g，约为其3倍，绝大多数昆虫不能完成整个幼虫期发育。2个高抗转基因株系之间没有明显差异。

2.3 741杨的适应性

为研究741杨生长的稳定性，在河北省内6个试验点设置无性系对比试验林。根据5个试验点6年生生长数据进行联合方差分析，证明无性系间在树高、胸径、材积3个性状上的地点效应、无性系效应及无性系与地点的互作效应均存在显著差异。741杨生长表现突出，在各试验点胸径和材积生长量均显著优于对照易县毛白杨，单株材积生长量平均超出40%。根据Ebehart和Rusell模型，对参试无性系的稳定性作进一步评估，估算出无性系对环境反应参数b(回归系数)和稳定性参数S_d²(离线性回归方差)，结果列于表 7。

Ebehart定义一个相对稳定的品种应为b=1，S_d²＝0。由表 1可知，741杨在树高胸径、材积上b值与平均回归系数(b=1)均无显著差异，S_d²值与0不显著，且3个性状平均值高于群体平均值。可见741是一个适应性广、稳定性强、生长量高的理想无性系，适宜在试区内大范围推广。易县毛白杨生长性状稳定性强，但生长量低，属于稳定慢生类型。

近年来，741杨已在河南、陕西、天津、北京、山东、甘肃等毛白杨适生区推广，均能正常生长，并表现出不同程度的速生特性，证明毛白杨具有较强的适应特性，可在毛白杨适生区推广应用。

2.4 转双抗虫基因741杨遗传变异性

将外源基因导入受体741杨，由于外源基因的切入具有偶然性，随机插入的外源DNA可能影响到受体本身基因组及性状表达。2001年在河北深县建立了转基因741杨无性系对比试验林，随机区组，4次重复，2株小区。2年生生长情况见表 8。

从表 8可以看出，转基因和未转基因741杨在胸径和树高上均显著优于毛白杨，对照741杨与转基因株系间均未达到显著差异。不同转基因株系间在胸径上存在一定差异，由于试验林仅有2年生，还不能确切说明转基因株系间存在遗传差异，还有待于作进一步测定。

对17个转基因株系的可溶性蛋白、参与重要生理代谢的等位酶进行电泳分析，测定了谷氨酸脱氢酶(glutamate dehydrogenase)、异柠檬酸脱氢酶(isocitrate dehydrogenase)、6－磷酸葡萄糖脱氢酶(Glucose-6-phosphate dehydrogenase)、草莽酸脱氢酶(shikimate dehydrogenase)、苹果酸脱氢酶(Malate dehydrogenase)、谷氨酸脱氢酶(glutamate dehydrogenase)荧光酯酶(esterase)、天冬氨酸转氢酶(aspartate aminotransferase)、磷酸葡萄糖异构酶(phosphoglucoisomerase)、苹果酸酶(malic enzyme)和磷酸葡萄糖变位酶(phosphoglucomutase)11种等位酶，均未发现转基因植株发生变异。进一步采用10条随机引物对17个转基因植株DNA进行随机RAPD扩增(见图 2)，未发现转基因植株DNA发生变异。表明外源基因转入后对测定的无性系生长等重要性状未产生明显影响。

3 讨论与建议

741杨具有明显的杂种优势，在生长速度、木材品质、结实特性、适应性等方面均优于对照毛白杨，表现出适应性广、稳定性强、生长量高的优良特性。经过22 a的无性系对比试验，证明与对照易县毛白杨相比，741杨在胸径生长具有明显优势，且随着年龄的增加，这种优势更加明显。在22年生时胸径生长量达到了43.17 cm，超出易县毛白杨29%。由于在胸径方面的生长优势，使得其材积生长量在22年生时超出易县毛白杨69%。双抗虫基因转入741杨中，通过初步的田间试验和实验室检测表明，选育出的具高抗虫性的株系，在生长发育、叶部形态等方面并未受到明显的影响。

虽然741杨生长速度比较快，但木材的品质并没有降低，与毛白杨和北京杨对比，在木材密度和多种木材力学性质上均表现优良。这可能是由于741杨树冠比较大，枝叶茂盛，光合同化面积较大，光合速率较高有关。对741杨苗期叶片光合分析表明，741杨在不同季节、不同叶龄的叶片特别是成熟以后的叶片，净光合速率和单叶同化率均明显高于对照易县毛白杨(杨敏生等，1991)。741杨木材洁白，尚未见其空心及腐心现象；连续3年观测表明，741杨为高度败育雌株，果穗小、数量少，成熟开裂前70%~90%脱落，基本不飞絮。

区域试验和稳定性分析表明，741杨在许多试验点均表现出明显的生长优势，单株材积在部分试验点平均超出易县毛白杨40%，是一个适应性广、稳定性强、生长量高的理想无性系，适宜在试区内大范围推广。经过十几年的推广应用证明，741杨可在毛白杨适生区推广。具体可在我国北纬30°~40°，东经105°~125°的范围内应用：河南、山东全省，京、津两市，河北长城以南及坝下地区，陕西关中一带，山西晋南各条河流流域，安徽北部淮北平原，江苏东北部，辽宁南部，甘肃天水、兰州以东等；还可往北扩展到内蒙古河套平原区，往西扩展到宁夏黄河冲积平原以及山西大同盆地；可试栽到我国西部河北杨、新疆杨的分布区内。要求比较深厚的土壤，对土壤质地适应性强；适栽于地下水位较高(1.5~4 m)的土地。降水量少的立地需有灌水条件，土壤pH6.5~pH8.5，耐土壤含盐量0.3%以下。

741杨转入外源基因后，其抗虫性得到提升，对杨扇舟蛾、舞毒蛾、美国白蛾等多种鳞翅目害虫具有高抗虫性，3个高抗株系的幼虫杀死率平均在80%以上，并能抑制存活的昆虫幼虫发育，使其发育龄期的历期延长，发育速率减缓，不能正常结茧。转双抗虫基因741杨是在一个植物表达载体上构建了2种不同杀虫机制的BtCry1Ac基因和慈菇蛋白酶抑制剂基因(API)。已报道的抗虫转基因植物多是转单一基因的，虽然这些植物对特定目标昆虫具有效毒杀或抑制生长发育作用，但长期使用这种植物必将使目的昆虫产生抗性。将2个或2个以上的不同抗虫基因转入植物，可获得同时表达多种抗虫基因的工程植株。由于不同抗虫蛋白在昆虫肠内的受体不同，或抗虫机制不同，这类抗虫植物可以达到提高杀虫效力、延缓害虫抗性产生的目的。试验证明，经过连续4年的抗虫性检测，未发现转基因741杨抗虫性随年代变化发生规律性下降的趋势。

转抗虫基因植株的应用可以产生巨大的抗虫效果，但存在的一些潜在问题也是明显的。除了环境安全上的问题外，害虫的耐受性是一个不容忽视的问题。广泛采用这种转抗虫基因杨树后是否会使害虫产生抗性演化。在转基因树木应用中，应采取措施将昆虫的抗性演化控制在一定程度。建议在转基因741杨的种植模式上，应采用多个转基因株系混合应用，包括具高抗虫性的株系和中等抗虫性的株系，同时还应栽种一些未转基因的741杨，从而保持转基因741杨林分多样性和稳定性，提高其对于环境的变化或来自群落内部种群波动的缓冲能力，降低抗性基因在昆虫种群内产生的几率，防止害虫产生抗性。