枣树(Ziziphus jujuba)枝条扦插极难生根，树体上能作接穗的枣头又少，加快枣树繁殖一直是枣树生产中一项亟待解决的问题。近年来，以枣树茎段培养进行苗木快速繁殖(张福泉，1983；刘仁贵，1988；罗晓芳等，1996；刘翠云等，1997)和苗木脱毒(田砚亭等，1993)的研究报道较多，但枣树茎段培养时极易产生不具繁殖作用的枣吊，增殖系数低。因此，枣树茎段培养进行苗木快速繁殖应用于生产还有成本高、繁殖率等问题需解决。另一方面，因试管苗不能贮藏、难以远距离运输以及成本较高等原因，其应用范围也受到了限制。植物人工种子是将培养物(包括体细胞胚、不定芽和小鳞茎等)包埋在含有营养成分和具有保护功能的胶囊中，在适宜条件下能够发芽成苗的颗粒体(Kamada et al., 1985)。它是由繁殖体、人造胚乳和人工种皮等3部分组成(许光学等，1992)，迄今的报道通常都将人造胚乳固化，使之具有保护功能，而不另使用人工种皮。用来制作人工种子的繁殖体通常是胚状体，但目前能诱导出胚状体的木本植物还很少，经济林木仅见有桉树(Eucalyptus spp.)(欧阳权，1980)、油茶Camellia spp.)(颜慕勤，1980)等2种植物。因而，寻求其他材料作为繁殖体，是近几年来人工种子研究的一个新的发展方向(Bapat et al., 1987；Muther et al., 1989；沈大棱等，1991；谷瑞升等，1998；何奕昆等，1997；王钰等，2002)。枣树胚状体诱导尚未成功，我们在枣树愈伤组织培养的基础上(何业华等，1998)，以枣树愈伤组织产生的不定芽为材料，进行了人工种子制作试验。

1 材料与方法 1.1 供试材料

枣树品种“鸡蛋枣”愈伤组织培养产生的不定芽。

1.2 繁殖体的获取

用鸡蛋枣愈伤组织培养诱导出不定芽(何业华等，1998)，当不定芽长至1~2 cm时，切取顶部3~4 mm作为繁殖体。

1.3 人工种子的制作

在由MS基本培养基成分和激素组成的胚乳介质中溶入海藻酸钠(质量浓度40 g·L^-1)，经121 ℃灭菌20 min，制成无菌包埋材料。在超净工作台内，将约40 mL包埋材料转入盛有繁殖体的50 mL烧杯中，用内径4 mm吸管将1个繁殖体连同包埋材料一起吸入，滴至CaCl₂溶液中，每滴体积0.5 mL左右。5 min后，液滴被固化为人工种子。将人工种子取出，用无菌水冲洗。

1.4 播种育苗

将制成的人工种子分别播种在无菌吸湿滤纸、无菌MS培养基、无菌土壤和未灭菌土壤上，前10天为暗培养，之后采用光培养(光照时间为14 h·d^-1，光强为2 000 1x)，培养温度为28 ℃。当芽突破种皮并长出0.5 mm时即视为已萌发，统计萌发率。每处理20个，重复4次。

1.5 人工种子贮藏

用含100 U·mL^-1青霉素、300 mg·mL^-1多菌灵的包埋材料制成人工种子，在30 ℃下干燥3 d后，分别贮藏在5、10、15、20 ℃下，相对湿度控制在80%~85%，每2周检查1次人工种子的发芽情况。每处理20个，重复4次。

2 结果与分析 2.1 CaCl₂对人工种子质量的影响

使用CaCl₂作络合剂，对包埋材料进行固化，使之成为种皮胶囊。CaCl₂浓度及浸泡时间不同，对种皮硬度和人工种子萌发均有重大的影响(表 1)。用1% CaCl₂时，浸泡5 min后未能使包埋材料固化；浸泡10 min后，人工种子表面虽已固化成膜，但内部仍为浆状，在转运和播种过程中极易破裂；浸泡15 min后，整个包埋材料内外均已固化，硬度适宜，不易破裂。当CaCl₂升至2%时，最佳浸泡时间缩短为10 min。而当此浓度下浸泡15 min后，种皮过于坚硬，播种后的繁殖体不能突破种皮而萌发。

2.2 激素对人工种子萌发的影响

人工种子播种4 d左右开始萌动，约7~8 d后芽突破种皮，14 d以后幼茎长度在5~20 mm左右。包埋材料中的激素组合对人工种子萌发有质的影响，适当的激素组合能大大提高萌发率(表 2)。当不添加激素时，萌发率仅1.5%，且都是无根苗；添加2 mg·L^-1 ZT+3 mg·L^-1 IAA时，所有繁殖体全部脱分化变成愈伤组织；分别添加2 mg·L^-1 ZT+3 mg·L^-1 KT+0.02 mg·L^-1 IAA和2 mg·L^-1 ZT+4 mg·L^-1 KT+0.2 mg·L^-1 NAA+4 mg·L^-1 AgNO₃时虽能获得68.5%和23.5%的萌发率，但全都是无根苗。只有0.1 mg·L^-1 ZT+0.5 mg·L^-1 IBA与0.5 mg·L^-1 IBA两组合所萌发的全部为正常苗，其中0.1 mg·L^-1 ZT+0.5 mg·L^-1 IBA组合比0.5 mg·L^-1 IBA的萌发率高出近110%。0.5 mg·L^-1 IBA为枣树组织培养时诱导不定根的适宜的激素及浓度(何业华等，1999)。因为人工种子所用繁殖体不像组织培养诱导不定根时是以带叶茎段为材料，而是用未展叶的芽，此时的芽体不仅要长根，还必须快速生长才能萌发。所以，除添加0.5 mg·L^-1 IBA外，还必须添加适量的细胞分裂素才能提高萌发率。

2.3 播种基质对萌发的影响

将刚制成的人工种子(包埋材料中附加了0.1 mg·L^-1 ZT+0.5 mg·L^-1 IBA)分别播种在已灭菌的MS固体培养基、湿滤纸、土壤及未灭菌的土壤等4种基质上，萌发结果表明，在无菌的基质上均能获得较高的萌发率。其中，尤其是含有丰富营养的MS固体培养基上萌发率最高，达89%；在无菌土壤中也达到75.5%的萌发率；在无菌湿滤纸上，虽有近71%的萌发率，但因后期营养缺乏而易黄化死亡。当播种到未灭菌的土壤中时，因芽体切口感染，到7天时, 已全部霉变死亡(图 1)。

2.4 人工种子贮藏

将制成的人工种子贮藏在不同温度下，分别于第14、28、42、56 d将其取出在无菌土壤上，其萌发情况见表 3。人工种子在5 ℃贮藏4周后萌发成正常苗的比率较直接播种时(75%)下降10%，贮藏8周后下降约53%，萌发率为35.7%。贮藏温度升高，芽体的生理活动增强，营养损耗增多，萌发率随贮藏时间的延长而加剧；但过低的温度(0 ℃)会造成芽体冻害而使其失去萌发力。

3 讨论

在以胚状体作繁殖体时，包埋材料中可以不加激素(李修庆，1990)。但以芽作繁殖体时，包埋材料中必须添加适当的激素，才能获得正常苗和较高的萌发率。在本试验中，不同的激素组合对人工种子的萌发及幼苗生长发育有重大影响，高浓度生长素与高浓度细胞分裂素组合会使繁殖体脱分化变成愈伤组织，而低浓度生长素与高浓度细胞分裂素组合则只形成无根苗，只有中等浓度生长素与低浓度细胞分裂素组合(即0.5 mg·L^-1 IBA+0.1 mg·L^-1 ZT)才有较高的萌发率。

用海藻酸钠作包埋基质，具有生物活性、无毒、胶囊有较好的强度、成本低、工艺简单等优点，因而为绝大多数研究者所采用(何业华等，2000)。但它也存在水溶性成份和助剂易渗漏、极易失水而又不能吸水回胀、制成的人工种子只能短期贮藏等缺点，而人工合成的高分子化合物作包埋基质时缺点更多。因此，仅用包埋基质包埋得到的人工种子，仍存在着强度小、不耐贮运和播种、保水保肥力差、极易受环境的影响、易污染等问题。还必须给人工种子涂上一层外皮，使之能克服上述弱点。这样一来，开发新型人工种子外皮材料具有重要意义，但这方面的研究工作进展还很缓慢。Redenbaugh等(1987)采用Elvax4260(乙烯-醋酸乙烯酯-丙烯酸三元共聚物)作外皮材料，不会降低苜蓿胚状体的发芽率，可用机器播种，其人工种子在露天环境中存放4 d胶囊重量仍保留有50%以上(桂进等，1992)。桂耀林等(1990)曾用Elvax4260作刺五加人工种子的外皮，使其强度和硬度得到明显改善，但播种试验表明，其胚状体的转株率比只用海藻酸钠包埋要低。另外，其价格昂贵也严重制约了它在生产上的应用。因此，研制出与天然种皮性能相似、价格低廉的人工种皮材料，是人工种子技术应用于生产的关键之一。

贮藏和防腐对人工种子同样重要，较低的含水量和贮藏环境的低温低湿是保持种子生活力的重要条件。我们在包埋材料中加入适量杀菌剂，贮藏在5 ℃条件下，8周后萌发率仍可达35.7%。由于海藻酸钠凝胶极易失水而又不能吸水回胀，贮藏环境的相对湿度一直保持在80%~85%，并使用了胶囊包裹。

用组织培养获得的不定芽作繁殖体制造人工种子，简便易行，在桑树(Bapat et al., 1987)、瓦氏缬草(Muther et al., 1989)、水稻(沈大棱等，1991)、甘薯(王钰等，2002)等植物上已获成功，在难于获得胚状体的植物中有很高的应用价值。但因不定芽难以大批量获得，切口又易感染，还必须在萌发过程中使其分化出不定根，因此，建立起枣树胚状体诱导技术体系，采用胚状体作繁殖体，是今后枣树人工种子研究的主要方向之一。