林业科学  2004, Vol. 40 Issue (5): 138-142   PDF    
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陈军, 杜孟芳, 尹新明, 王学聘, 卢孟柱.
Chen Jun, Du Mengfang, Yin Xinming, Wang Xuepin, Lu Mengzhu.
抗光肩星天牛苏云金芽胞杆菌Bt886菌株的分离及对毒蛋白编码基因的初步鉴定
Selection of Bacillus thuringiensis Strain against the Longhorned Beetles and Preliminary Characterization of Its Insecticidal Gene
林业科学, 2004, 40(5): 138-142.
Scientia Silvae Sinicae, 2004, 40(5): 138-142.

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收稿日期:2004-03-09

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陈军
杜孟芳
尹新明
王学聘
卢孟柱

抗光肩星天牛苏云金芽胞杆菌Bt886菌株的分离及对毒蛋白编码基因的初步鉴定
陈军1 , 杜孟芳2 , 尹新明2 , 王学聘1 , 卢孟柱1     
1. 中国林业科学研究院林业研究所  国家林业局林木培育重点实验室  北京 100091;
2. 河南农业大学植物保护学院  郑州 450002
摘要: 从拟谷盗虫尸中分离到一株对鞘翅目害虫光肩星天牛幼虫毒杀作用明显的Bt菌株Bt886。幼虫死亡率高达6 0 %, 存活者生长明显受到抑制。经过晶体形态特征和杀虫谱分析, 初步确认该菌株属于cry3类。比较cry3类基因的保守序列, 利用一对cry3特异引物成功地从Bt886菌株中克隆到了一段基因片段并克隆至pGEM -T载体上。测序分析发现该片段与cry3Aa1基因具有很高的同源性, 确定来自毒蛋白编码基因。Southern杂交分析表明该基因位于该菌株的质粒上。
关键词: 天牛    Bt菌    cry3A基因    Southern杂交分析    
Selection of Bacillus thuringiensis Strain against the Longhorned Beetles and Preliminary Characterization of Its Insecticidal Gene
Chen Jun1, Du Mengfang2, Yin Xinming2, Wang Xuepin1, Lu Mengzhu1     
1. Research Institute of Forestry, CAF Key Laboratory of Forest Silviculture of the State Forestry Administration  Beijing 100091;
2. College of Plant Protection, Henan Agricultural University  Zhengzhou 450002
Abstract: A Bacillus thuringiensis strain Bt886 toxic to Longhorned Beetle (Anoplophora glabripennis) larvae were isolated from dead body of Tribolium macleby. The larvae fed with Bt886 exhibited high mortality (60%) and significant delay in growth. The shape of its crystal and spectrum of affected insects indicated that Bt886 could harbor cry3 like genes. A pair of primers was designed based on the conservative region of cry3 genes and a DNA fragment was successfully obtained by amplification. The fragment was further cloned into pGEM-T and the sequence analysis showed highly homologous to cry3 Aa1 gene with only one nucleotide difference. The fragment was located on plasmid of Bt886 by Southern analysis.
Key words: Longhorned Beetle    Bacillus thuringiensis    cry3A gene    Southern analysis    

天牛是我国林木的主要蛀干害虫之一,其危害性质严重,寄主范围广而杂,给我国人工林建设造成了严重影响(骆有庆等, 1999; 张世权, 1994)。在北方的杨树人工林中,天牛危害是一类毁坏性质极其严重的森林虫害。对天牛的防治大致经历了化学防治、种群综合治理以及生物防治等几个阶段,但是其效果都不佳,而且操作难度大(李文杰等, 1993; 熊善松, 1995; 黄大庄, 1996)。苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)是一种革兰氏阳性菌,在芽孢形成过程中产生的伴胞晶体对害虫具有杀虫作用,被称为δ-内毒素或杀虫晶体蛋白。苏云金芽孢杆菌制剂是目前世界上产量最大的微生物杀虫剂,广泛用于防治农、林害虫。苏云金芽孢杆菌是目前分离抗虫基因的主要来源之一。自1987年比利时植物遗传系统公司首次报道通过转Bt基因已获得了抗虫转基因植株(Schnepf et al., 1998)以来,转Bt基因的烟草(Nicotiana tabacum)、棉花(Gossypium hirsutum)先后经过大田试验后,进行了推广应用。在林木上,黑杨(Populus nigra)、欧洲落叶松(Larix decidua)、白云杉(Picea glauca)、核桃(Juglans regia)等也获得转Bt基因植株(林良斌等, 1997; Michael et al., 1992; 崔洪志, 1996; 吴中心, 1995; 郭三堆, 1995)。其中转Bt基因的欧洲黑杨,经过虫试,发现对舞毒蛾(Lymantria dispar)和春尺蠖(Apocheima cinerarius)的抗虫率达50%~100%(胡建军等, 1999),并获得了商品化许可。但目前林木转基因研究主要针对鳞翅目害虫,对天牛具有毒杀作用的苏云金芽孢杆菌菌株及相关基因的研究还未见有报道。本研究旨在从苏云金芽孢杆菌资源库中筛选出对天牛具有毒杀作用的菌株,并对其杀虫基因进行初步鉴定,为进一步分离杀天牛基因,用于基因工程抗虫育种奠定基础。

1 材料与方法 1.1 Bt886菌株的分离与特征观察

将拟谷盗(Tribolium macleby)幼虫虫尸置于牛肉膏-蛋白胨培养基平板上,30℃±1℃培养1~2 d,待长出菌苔,采用划线法进行纯化,挑取单菌落,涂片,碱性复红染色,显微镜观察。

1.2 Bt886菌株对天牛幼虫的室内生物测定

经过对鞘翅目昆虫榆毛胸萤甲(Pyrrhalta aenescens)、黄粉甲(Tenibrio molitor)的虫试,初步确认苏云金芽孢杆菌菌株Bt886作为杀天牛的候选菌株。为进一步鉴定苏云金芽孢杆菌菌株Bt886对天牛幼虫的毒杀能力,以室内饲养的2龄光肩星天牛(Anoplophora glabripennis)幼虫为试虫,对苏云金芽孢杆菌菌株Bt886进行室内生物测定。以产生菱形伴胞晶体的苏云金芽孢杆菌菌株Bttolw和水作为对照。采用室内人工饲养的2龄光肩星天牛对菌株进行生物活性测定。

以试管斜面培养基上生长48 h左右、生长良好的Bt细菌培养物悬浮于适量的无菌蒸馏水中,震荡后制备成均匀的菌悬液为材料,拌入天牛人工饲料中,在小塑料瓶中进行毒力测定,每瓶一头天牛,每个处理10头,以清水拌入天牛人工饲料为对照。此外,为了更为真实地模拟天牛幼虫在自然环境中的取食状态,尽量减少其它人为因素的干扰,本实验还设计了一种新的天牛幼虫生物测定方法-枝条法,并进行了小量试验。即将构树(Broussonetia papyrifera)枝条(1.0~1.5)cm×(7.0~8.0)cm从中心剖开后,中间挖槽,将制备的菌悬液滴于槽中,晾干后放入一头幼虫,合上枝条,用封口膜缠紧,然后立于放有滤纸的培养皿中(加水使滤纸保持潮湿)。

1.3 抗性基因片段引物的设计及扩增

在GenBank数据库检索苏云金芽孢杆菌杀鞘翅目的cry3类基因,用Clustal X软件分析他们的保守区,并设计了4对引物(图 1)。

图 1 PCR引物序列 Fig. 1 Sequence of designed PCR primers

以Bt886菌株的质粒(按北京鼎国生物公司质粒提取试剂盒提取)为模板进行PCR扩增。PCR反应体系为:在20 μL的反应体积中质粒模板20 ng,正反向引物浓度均为0.8 pmol·L-1,10 X缓冲液(含Mg2+)2 μL,2.5 mmol·L-1的dNTPs 1 μL,Taq酶1U。反应条件:94℃预变性3 min,然后开始94℃变性1 min;54℃退火1 min;72℃延伸1.5min的循环,共30次。产物用1%琼脂糖凝胶电泳后,溴化乙锭染色后观察。

1.4 克隆载体构建

采用Amicon Microcon-PCR Centrifugal Filter Devices(购自Millipore Corperation)对基因保守片段的PCR产物进行纯化,并采用T4连接酶对纯化好的PCR产物和质粒载体(pGEM -T)进行连接,转化大肠杆菌JM109(张玉静, 2000)。

1.5 序列分析

采用T载体pGEM-T上的测序引物T7和SP6从两端对所克隆的片段进行序列测定,由上海联合基因公司完成。

1.6 Southern杂交分析

PCR产物纯化后采用DIG High Prime DNA Labeling and Detection Kit Ⅰ (Clontech公司)标记PCR产物作为探针,与Bt886菌株质粒DNA的Hind Ⅲ完全酶切产物进行了杂交,具体过程按试剂盒说明书及分子克隆实验手册上的方法进行(Sambrook et al., 1989)。

2 结果与讨论 2.1 菌株培养特征及形态特征

拟谷盗虫尸分离物在牛肉膏-蛋白胨培养基上菌落培养特征为圆形、乳白色。菌落经涂片、碱性复红染色、显微镜观察其形态特征为:营养体粗壮、直形杆状,两端钝圆,大小为(1.2~1.8)μm×(3.0~5.0)μm。孢子囊较营养体稍膨胀,产生卵圆形孢子,大小为(0.8~1.0)μm×2.0μm,同时伴生方形伴孢晶体。而电镜照片表明:孢子为卵圆形,晶体蛋白为方形(图 2),具有苏云金芽杆菌的典型特性。

图 2 Bt886杀虫蛋白晶体形态 Fig. 2 Insecticidal protein crystal of Bt886
2.2 天牛虫试

人工饲料法测定结果如表 1所示。菌株Bt886对人工饲养的光肩星天牛2龄幼虫具毒杀作用,其死亡率均在60%以上(图 3)。未死亡幼虫与对照幼虫相比,体重明显减轻。与对照试虫相比,60 d后的试虫体重只占对照的61.5%,而且不能正常取食、蜕皮和发育。同时,又采用枝条法对光肩星天牛幼虫进行了虫试,结果10头试虫在第10天检查时已经全部死亡,死亡率达100%,前4 d死亡率为70%,所有对照试虫则全部存活,而且生长健康。这些结果表明,Bt886对天牛幼虫具有较强的杀虫活性。

表 1 Bt菌株对光肩星天牛幼虫室内生物测定 Tab.1 Bioassay of B. thuringiensis strains to A. glabripennis larvae under the control condition
图 3 虫试中死亡变黑的虫尸与对照幼虫 Fig. 3 The black dead bodies and healthy larvae of A. glabripennis after the bioassay
2.3 保守序列片段的PCR扩增

以Bt886菌株的质粒DNA为模板,用Primer1、Primer2、Primer3、Primer4四对保守区序列引物分别进行PCR扩增。扩增产物用1%的琼脂糖凝胶电泳检测,结果发现第四对引物Primer4能从试验菌株Bt886的质粒DNA中扩增出一条约0.8kb左右的特异性条带(见图 4)。

图 4 Primer 4扩增产物电泳结果 Fig. 4 PCR product amplified by primer 4 on agarose gel 1、2为PCR产物电泳结果Lanes 1 and 2 are PCR product; 3 DNA分子量标准DNA standard Marker.
2.4 序列分析

克隆的基因片段经纯化后克隆到pGEM-T中并进行了测序。该片段长817 bp (图 5),GC含量较低,为35.86%。比较Bt886片段序列与已发表的cry3Aa1基因相应部分的核苷酸序列,发现一个碱基不同,即第668个核苷酸在cry3Aa基因为“A",在Bt886中为“T"。

图 5 Bt886扩增片段的序列 Fig. 5 Sequence of the amplified fragment from Bt886
2.5 杀虫基因定位于质粒上

Hind Ⅲ限制性内切酶对从Bt886菌株中提取的质粒进行完全酶切,并用地高辛标记的保守区片段为探针进行杂交检测。结果如图 6所示。在3.0 kb处有一条阳性杂交带,表明该片段中携带编码毒蛋白的基因。由于cry3A大小在2kb,因此推测在该质粒上只有一个拷贝。

图 6 Bt886质粒(左)及Southern(右)杂交结果 Fig. 6 Bt886 plasmids and Southern blotting analysis 左1、2泳道为未酶切质粒,右1、2泳道为酶解产物;泳道3DNA Marker Left:Lanes 1 and 2 are the plasmid without enzymatic digestion, Right:Lanes 1 and 2 are plasmid with enzymatic digestion, Lanes 3 is standard marker.
3 讨论

在以往的研究中,虽然发现不少对鞘翅目昆虫具有较高毒性的Bt菌株,但大多数是针对马铃薯甲虫和榆毛胸萤叶甲等鞘翅目昆虫(高梅影等, 1999; 乐超银等, 2000)。目前,还没有看到有关对天牛害虫具有较高毒杀力和抑制作用的Bt菌株的报导。本研究分离出了的Bt886菌株,通过天牛虫试,得到60%以上的死亡率,说明该菌株对天牛的作用较明显。鉴于本次天牛幼虫数量所限,没有进行统计分析。将来进一步增加天牛试虫数,以提供更有力的证据。

质粒杂交表明该菌株携带cry3Aa类基因,可能以单拷贝位于质粒上。所扩增的817 bp长的cry3Aa基因片段,与已报道的相比,有一对核苷酸发生了改变,并且位于该基因的结构功能域Domain Ⅰ中Block 1与Block 2之间(Schnepf et al., 1998)。虽然有报道表明点突变可能导致基因的功能的变化,并在进化中有一定的意义(Jurat-Fuentes et al., 2001; Masson et al., 2002张玉静, 2000),但要确定该基因的杀天牛活性是否与碱基突变有关,尚需对全长基因进行克隆和测序,分析全长基因的变异,并进一步通过定点突变进行功能验证。

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