华山松大小蠹(Dendroctonus armandi)是秦岭巴山林区优质针叶树种华山松的毁灭性害虫，在入侵、定居和繁殖的整个生命过程中不仅需要共生真菌的参与，以有效克服健康华山松组织结构和生理生化等多元抗性，而且与共生真菌在生理生化代谢上具有相互的协调性，使华山松大小蠹和共生真菌能够充分地利用寄主树木组织中各种营养物质(陈辉等，2000；唐明等，1999)。Graham(1967)认为小蠹虫与真菌的共生是小蠹虫与真菌充分利用森林生态系统内寄主树木纤维素、半纤维素和木质素等营养物质的适应性进化结果。Stark(1965)、Graham(1967)、Whitney(1982)、Paine(1997)和陈辉等(2000)的研究表明，小蠹虫、共生真菌和寄主树木间相互适应而进行的协同进化，不仅表现在小蠹虫和真菌的形态学、生物学、生理学、生态学和行为学等方面，而且表现在小蠹虫与真菌的生理生化和代谢方面。本文通过对华山松大小蠹(Dendroctonus armandi)与主要真菌间酶分泌的差异性研究，揭示华山松大小蠹与真菌营养利用的相互依赖性及互惠共生的机制。

1 材料与方法 1.1 华山松大小蠹消化道和共生真菌胞外蛋白及酶的提取

将饥饿48 h后的华山松大小蠹成虫，用75%乙醇进行表面消毒，无菌水冲洗数次后，取出其消化道，并按每个消化道加入40 g·L^-1蔗糖提取液0.5 mL, 冰浴下匀浆，低温(4℃)离心10 min(12 000 r·min^-1)，取上清液作为成虫消化道测试蛋白和酶源(蒋书楠，1996)。

将华山松大小蠹共生真菌Leptographium qinlingensis分别接种于纤维素诱导液体培养基、漆酶诱导液体培养基和麦芽汁液体培养基(分别记作A, B, C)中，25℃培养8 d后用尼龙布过滤，滤液置于高速离心机离心10 min(12 000 r·min^-1)。取上清液作为共生真菌胞外测试蛋白和酶源(高培基等，1985；郭杰炎等，1986；黄镇亚，1985)。

1.2 华山松大小蠹成虫消化道和共生真菌胞外蛋白及酶的分析

采用聚丙烯酰胺凝胶垂直板电泳法进行电泳分析。酯酶同工酶、淀粉酶同工酶、纤维素(Cx酶)同工酶分离胶浓度7.5%，浓缩胶浓度3%，漆酶同工酶分离胶浓度10%，浓缩胶浓度3%，但在纤维素(Cx酶)同工酶和蛋白酶工酶分离胶中分别加入0.8 g·(10 mL)^-1羧甲基纤维素钠5 mL和0.8 g·(10 mL)^-1明胶5 mL恒流电泳，先1 mA·cm^-1 30 min，后2 mA·cm^-1 (王中仁，1996；张树政等，1987)。

蛋白分析采用硝酸银和考马斯亮蓝R-250染色法。蛋白带迁移率R_f=x₂/x₁(x₂该带存分离胶上的迁移距离，x₁电泳指示剂在胶上的迁移距离)(严东辉等，1997)。酶分析：酯酶同工酶用固蓝B盐、乙酸-α-萘酯和乙酸-β-萘酯显色(陈毓荃，1999)；淀粉酶同工酶用碘-磺酸钾显色(黄镇亚，1985)；纤维素(Cx酶)同工酶用碘化钾-碘液染色，60%硫酸显色(李庆，1996)，漆酶同工酶用O-甲氧基苯酚法染色(方自若等，1985；刘尚旭等，2000)；蛋白酶同工酶用氨基黑10B显色(严东辉等，1997)。

2 结果与分析 2.1 华山松大小蠹消化道和共生真菌胞外蛋白分析

分析结果表明：华山松大小蠹消化道凝胶电泳在银染色中呈现出14条蛋白带，在考马斯亮蓝R-250染色中仅显示6条蛋白带；共生真菌在银染色中显示出9条蛋白带，在考马斯亮蓝R-250染色中仅显示3条蛋白带，且在不同培养基上呈现出不同的蛋白带。同时，华山松大小蠹成虫消化道蛋白带与共生真菌胞外蛋白带迁移率也存在明显差异，表明培养基内容物对共生真菌胞外蛋白的分泌有极大的影响。由此可见，华山松大小蠹消化道和真菌可向体外和胞外分泌多种可溶性蛋白，但两者分泌蛋白的组成和含量不同(图 1-a、b)。

2.2 华山松大小蠹消化道和共生真菌胞外酶组成分析 2.2.1 纤维素酶

在相同加样量的情况下，共生真菌能显示出纤维素酶带，且不同培养诱导条件下，酶带迁移率也有差异，其中纤维素诱导培养基培养的显示出4条酶带，而麦芽汁培养基培养的则不显示纤维素酶带，表明共生真菌胞外纤维素酶具有很强的底物诱导性。华山松大小蠹消化道也具有分泌纤维素酶的能力，在凝胶电泳板上显示出3条酶带，其中一条最大迁移率达R_f=0.9，远大于共生真菌(图 2)，说明华山松大小蠹消化道诱导分泌的纤维素酶与共生真菌胞外诱导的纤维素酶在分子结构上具有明显的差异。

2.2.2 淀粉酶

华山松大小蠹消化道具有较为丰富的淀粉酶同工酶，凝胶电泳中呈现4条酶带，且各酶带相对迁移率均较大，最大迁移率达R_f=0.82。而由纤维素诱导培养基培养的共生真菌呈现出3条酶带，麦芽汁培养基培养的只显示1条酶带(图 3-a)。并且共生真菌胞外淀粉酶的迁移率与华山松大小蠹消化道淀粉酶的迁移率具有显著差异，表明华山松大小蠹消化道分泌的淀粉酶与真菌胞外淀粉酶在结构上具有差异。

2.2.3 酯酶

华山松大小蠹消化道和共生真菌胞外均能分泌酯酶同工酶，且种类较多。华山松大小蠹消化道显示9条酯酶同工酶酶带，最大迁移率R_f=0.76；而在3种培养基上培养的共生真菌均显示出酯酶酶带，其中在纤维素诱导培养基培养的酯酶同工酶带最多达9条，在漆酶诱导培养基上培养的显示出5条酯酶同工酶酶带，而在麦芽汁培养基上培养的仅显示出4条酯酶酶带(图 3-b)。这说明华山松大小蠹消化道分泌的酯酶与共生真菌向胞外分泌的酯酶在结构上有明显的差异。

2.2.4 蛋白酶

华山松大小蠹消化道及共生真菌胞外蛋白酶的电泳染色结果表明，华山松大小蠹消化道和共生真菌胞外均能分泌大量的蛋白酶。可能由于蛋白酶分子结构较大，其电泳迁移率较小。同时，由于蛋白酶在泳动过程中与胶板底物明胶相互作用，导致染色结果出现整条亮带，而无法分清酶带数。但仍可看出华山松大小蠹消化道蛋白酶迁移率较高R_f=0. 54，而共生真菌胞外蛋白酶迁移率较低(最大迁移率仅R_f=0.42)。这也说明共生真菌胞外分泌的蛋白酶与华山松大小蠹消化道分泌的蛋白酶在结构上不完全相同(图 3-c)。

2.2.5 漆酶

漆酶为一类典型的诱导酶，在培养液中加入底物愈创木酚时，可以诱导共生真菌分泌漆酶，明显可见发酵液变成红色，但在华山松大小蠹消化道粗酶液中加入底物时，未见出现红色。在加样量相同的情况下，仅在漆酶诱导培养基上培养的共生真菌呈现出漆酶单一酶带，这表明共生真菌具有胞外诱导分泌漆酶的能力，但含量较低；而华山松大小蠹消化道不具有分解木质素漆酶的能力(图 3-d)。出现上述情况可能与诱导底物非华山松大小蠹消化道和共生真菌胞外漆酶最适底物有关，也可能与华山松天然木质素存在较大差异有关。

3 结论与讨论

华山松大小蠹和共生真菌酶代谢的差异性是二者利用寄主华山松韧皮部和木质部组织营养和协同进化的基础。华山松大小蠹主要依靠其消化道分泌的纤维素酶、淀粉酶、酯酶、蛋白酶等，直接利用寄主华山松韧皮部和木质部边材组织内的纤维素、半纤维素、淀粉、多糖、脂类和蛋白等营养物质。而共生真菌则依靠胞外分泌的纤维素酶、淀粉酶、酯酶、蛋白酶和漆酶等，分解利用、酯酶、蛋白酶，直接利用华山松木质部管胞细胞间和细胞内、薄壁细胞和树脂道泌脂细胞内和细胞间的营养成分。同时，华山松大小蠹和共生真菌由于酶结构的差异性，使二者在利用寄主树木营养成分上表现出分化与协作，华山松大小蠹依靠共生真菌分解寄主华山松韧皮部和木质部边材组织内纤维素、半纤维素、木质素、淀粉、酯类物质，使健康寄主华山松韧皮部和木质部内难以直接利用的高分子物质被分解为小分子物质，从而使华山松大小蠹对寄主树木营养的利用率大大提高。

华山松大小蠹共生真菌胞外纤维素酶和漆酶的底物诱导性，使共生真菌在华山松大小蠹成虫携带入侵健康寄主华山松后，在寄主华山松韧皮部和木质部纤维素和木质素底物的诱导下，迅速合成和分泌纤维素酶和漆酶，不仅有效克服寄主华山松韧皮部和木质部组织结构抗性，而且为华山松大小蠹提供了间接利用寄主华山松纤维素、半纤维素和木质素营养的途径，也使华山松大小蠹与共生真菌的互惠共生关系将更加紧密。