林业科学  2004, Vol. 40 Issue (5): 105-109   PDF    
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胡建军, 张蕴哲, 卢孟柱, 张建国, 张守攻.
Hu Jianjun, Zhang Yunzhe, Lu Mengzhu, Zhang Jianguo, Zhang Shougong.
欧洲黑杨转基因稳定性及对土壤微生物的影响
Transgene Stability of Transgenic Populus nigra and Its Effects onSoil Microorganism
林业科学, 2004, 40(5): 105-109.
Scientia Silvae Sinicae, 2004, 40(5): 105-109.

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收稿日期:2003-05-23

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胡建军
张蕴哲
卢孟柱
张建国
张守攻

欧洲黑杨转基因稳定性及对土壤微生物的影响
胡建军 , 张蕴哲 , 卢孟柱 , 张建国 , 张守攻     
中国林业科学研究院林业研究所  国家林业局林木培育重点实验室  北京 100091
摘要: 利用PCR分析技术,分析了田间试验已达7 a的转Bt基因欧洲黑杨的基因稳定性,并对其林地和非转基因林地的土壤微生物进行了类群数量分析。PCR分析表明Bt基因仍然存在于转基因植株中,转基因植株与对照杂交后代Bt基因分离呈1:1比例,符合孟德尔遗传分离规律,表明基因仍稳定存在。计数结果表明转基因林地中转基因植株与非转基因植株间根系土壤3大类微生物(细菌、放线菌和霉菌)数量无显著差异,转基因林地与非转基因林地(邻近杨树林地和健杨林地)间的土壤3大类微生物(细菌、放线菌和霉菌)数量无显著差异,说明转基因欧洲黑杨对土壤微生物系统尚没有明显的影响。
关键词: 欧洲黑杨    转基因植株    基因稳定性    土壤微生物    生物    
Transgene Stability of Transgenic Populus nigra and Its Effects onSoil Microorganism
Hu Jianjun, Zhang Yunzhe, Lu Mengzhu, Zhang Jianguo, Zhang Shougong     
Research Institute of Forestry, CAF Key Laboratory of Forest Silviculture of the State Forestry Administration  Beijing 100091
Abstract: It is more than seven years since transgenic Populus nigra carried Bacillus thuringiensis (Bt) gene has been tested in the field. By PCR technology, the gene stability of transgenic P. nigra with Bt gene was analyzed, and the soil microorganism in the transgenic plantation and non-transgenic plantation was quantitatively assayed for group.According to PCR analysis, Bt gene was still in the transgenic P.nigra trees, and Mendelian segregation of Bt gene was observed in the progeny of transgenic P.nigra (clone 153) crossed with control (CK3). In order to evaluate the effects of transgenic forest trees on the environment biosafety, we surveyed three groups of microorganisms (bacterium sum, actinomyces and mould) in the soil around the roots of both non- and transgenic trees, and of both non- and transgenic plantations. Analyzing using ANOVA, we have found no significant difference in terms of the microorganism number among both the individual trees and the plantations. It indicates that there are still no significant negative effects of transgenic poplar on the soil microorganism system.
Key words: Populus nigra    Transgenic plant    Gene stability    Soil microorganism    Biosafe    

自从20世纪80年代末林木转基因植株获得以来,许多林木外源基因转化成功。在国外,由于转基因林木生态环境安全性的原因,一直处于实验室或苗圃试验阶段。我国于1993年获得转苏云金芽孢杆菌毒蛋白(Bacillus thuringiensis, Bt)基因的欧洲黑杨(Populus nigra)植株(田颖川等,1993),1994年营造了田间试验林,进入田间试验阶段。经田间抗虫评价,转Bt基因欧洲黑杨在田间表现了明显的抗虫效果(胡建军等,1999Hu et al., 2001)。

目前有关转基因农作物的生物安全研究较多,其中主要涉及对非目标昆虫、农田生态系统影响, 以及基因漂移等,但在转基因林木方面的报道很少。林木转基因生物安全性主要包括转基因的稳定性、外源基因向天然群体的基因漂移及对非目标生物的影响等,但Wolfenbarger等(2000)认为转基因植物对环境的影响仍缺乏关键试验。在我国新疆营造的树龄已达7 a的转基因欧洲黑杨试验林,为研究转基因林木的生物安全性提供了有利条件。本文报道了对转基因欧洲黑杨的外源Bt基因存在、转基因稳定性及对土壤微生物的影响的研究结果。

1 材料和方法 1.1 试验地概况

转Bt基因抗虫欧洲黑杨田间试验林位于新疆维吾尔自治区北部玛纳斯平原林场(43°13′N,86°37′E),海拔470 m,沙壤土,适合杨树生长。试验林造于1994年春季,面积1 hm2,邻近杨树林地为西+加杨,该无性系为西伯利亚杨(P. suveolens)嫁接于加拿大杨(P. canadensis)上培育而成。对照健杨(Peuramericana cv. ‘Robusta')林在试验林东面,相距6 km,面积1 hm2,树龄7 a,树高14 m左右。

在转基因试验林中,共有17个系号参加田间测试,其中包括14个转Bt基因植株、2个未转化对照(CK2, CK3)和当地栽培品种健杨,共6个区组,每一区组中5~6个无性系单株,6次重复,随机排列。

1.2 取样及测定

2001年5月中旬在转基因试验林中,选取转基因植株和非转基因植株各5株,采集刚展开的叶片,带回实验室液氮提取DNA,利用设计并合成的一对Bt基因特异引物(引物1:5′-GAA TTC GCT AGG AAC CAA GCC ATT-3′;引物2:5′-AAG TAT ATC CAT CAA ATG TGG ACT-3′)进行了PCR、定量PCR检测。

从转基因植株(153号)和对照(CK3)采集雌雄花枝,温室水培,进行人工控制授粉杂交试验,获得了约1 000粒种子,播种于营养杯中,移植到苗圃获得了约300株幼苗。从其中120株采集叶片,提取DNA,采用PCR方法检测了转基因植株数量。用卡方检验分析了转基因和非转基因植株数是否符合孟德尔遗传规律。

在转基因林地中从欧洲黑杨转基因株系12、153、172号和对照健杨、欧洲黑杨未转化植株CK2和CK3株系各选择3株,采集了根系土壤样品;从转基因林地、邻近杨树林地和对照健杨林地,随机5点采集土样。土样采集后冷藏(5℃),进行土壤微生物分析,分别在配制的牛肉膏培养基、阿须贝培养基、高氏培养基和马丁培养基上对样品培养,并对普通细菌、有固氮能力的细菌、放线菌以及霉菌计数,普通细菌和有固氮能力的细菌合计为细菌总数。利用Spss10.0软件对数据进行统计分析。

2 结果与分析 2.1 外源Bt基因稳定性分析

从欧洲黑杨转基因植株和非转基因植株叶片中提取DNA,进行PCR分析(图 1)。结果表明,所有的转基因欧洲黑杨均呈现Bt基因阳性结果。为进一步确定PCR扩增的基因为Bt基因,选取4个PCR阳性的植株,重新提取样品作定量PCR分析(图 2)。图 2A显示阳性对照(CK+质粒,14kb,约含6×106个Bt基因拷贝)先在第18个循环出现对数增加,接着4个PCR阳性转基因植株在第24~26个循环出现,并与依据模板量推测的约106个Bt基因拷贝相符,而阴性对照(CK-)到第32个循环才出现非特异扩增。为验证产物是否为Bt基因片段,对扩增产物作溶解曲线(图 2B),结果说明4个PCR阳性样品与阳性对照一样,在77.6℃发生特异解链(图 2B中在该温度处,解链引起荧光强度的骤然下降及其变化而出现峰值),而阴性对照在该温度没有明显的变化。这些结果说明,在大田种植7 a后,Bt基因仍然在转基因植株中存在,未发生丢失现象。

图 1 转基因试验林中转基因欧洲黑杨植株与非转基因植株PCR结果 Fig. 1 PCR analysis of transgenic P. nigra and non-transgenic poplar in the transgenic plantation 1:标准分子量DNA marker; 2~11:阳性植株Positive plants; 12~15:阴性植株Negative plants; 16~17:对照Controls(CK2, CK3); 18:健杨Peuramericana cv. ‘Robusta'.
图 2 转基因试验林中欧洲黑杨转基因植株的定量PCR扩增曲线(A)及产物的解链温度(B)分析 Fig. 2 Real-time PCR amplification (A) of transgenic P. nigra plants and me lting analysis (B) of their products
2.2 转基因欧洲黑杨的遗传分析

以转基因植株153号为母本,非转基因植株CK3为父本进种内杂交,获得F1代个体,对父母本及F1代共120个个体进行PCR检测(图 3),杂交后代中Bt阳性植株67株,阴性植株53株。经卡方检验分析,χ2=0.96 < χ0.052=3.84,分离比例为1:1,说明外源Bt基因为单拷贝基因,遵从孟德尔单显性基因分离规律。表明7 a后Bt杀虫蛋白基因未发生丢失、增加等拷贝数的改变,转基因仍非常稳定。Bt杀虫蛋白基因呈单显性基因分离规律同样在转基因玉米(Zea mays)、水稻(Oryza sativa)、油菜(Brassica napus)、不结球白菜(Brassica campestris ssp. chinensis)等农作物中发现(刘允军等,2003姚方印等,2002林良斌等,2002佘建明等,2002)。

图 3 欧洲黑杨转基因植株杂交后代外源Bt基因的PCR检测 Fig. 3 PCR analysis of Bt gene in the progeny of transgenic P. nigra
2.3 根系周围土壤微生物的比较

分别对转基因试验林中转基因植株与非转基因植株根系周围的土壤微生物进行分类计数,并作统计分析(表 1)。经方差分析和多重比较,转基因植株(12,153和172)与非转基因植株(CK2、CK3和健杨)之间的根系周围细菌总数、放线菌和霉菌数量也无显著差异(表 3)。

表 1 欧洲黑杨转基因植株和非转基因植株根系周围微生物总数比较 Tab.1 Comparison of microorganism in the soil around transgenic plant and non-transgenic plant roots
2.4 林地间土壤微生物的比较

分别对转基因林地、邻近杨树林地和健杨林地土壤微生物进行分类计数,并作统计分析(表 2)。经方差分析和多重比较,转基因林地与非转基因林地(邻近杨树林地和健杨林地)之间的细菌总数、放线菌和霉菌数量无显著差异(表 3)。

表 2 转基因林地与非转基因林地土壤微生物总数比较 Tab.2 Comparison of microorganism in the soil of transgenic and non-transgenic plantations
表 3 根系周围及林地土壤微生物数量方差分析结果 Tab.3 ANOVA results of microorganism in the soil of root and plantation

由于转基因欧洲黑杨植株和非转基因植株的3大类根系土壤微生物数量无显著差异,并且转基因林地和非转基因林地土壤微生物也无显著差异,初步说明转基因欧洲黑杨对土壤微生物系统没有明显的影响。

3 结论与讨论

本研究经过PCR及定量PCR分析表明,转Bt基因欧洲黑杨进入田间试验7 a后,转基因植株外源Bt基因仍然稳定整合在核基因组中。该结果与田颖川等(1993)Wang等(1996)Sala等(2000)的PCR、Southern blot检测结果相吻合。而且,尚未发现转Bt基因欧洲黑杨植株对土壤微生物种类和数量产生明显影响。

转基因植物的转基因稳定性是评价其安全性的前提,转基因稳定存在和表达,是其对环境产生影响的基础。在转基因作物上已经报道了转基因沉默及失活、在基因组中发生位移、扩增等现象(程海鹏等,2001)。本研究通过检测Bt基因的存在,以及采用杂交试验说明了杨树这种靠无性繁殖的树木,其携带的转基因有较强稳定性,且在基因组中位置稳定、拷贝数保持不变,并符合孟德尔单显性基因分离规律。这一研究结果表明,这类多年生的树木能够长期、稳定表达基因产物,因此其对生态环境的影响需要进行严格的评估。

根系分泌物组分的差异对土壤理化性质、土壤生物系统有不同程度的影响,但转基因植物在这方面的报道还很少,仅限于对外源基因和蛋白在土壤中的残余量及毒性进行检测和试验。Smalla等(1994)利用PCR技术分析了转基因甜菜(Beta vulgaris)和马铃薯(Solanum tuberosum)外源DNA在土壤中的残留情况,发现DNA可在土壤中持续存在。Palm等(1996)将转Bt棉花(Gossypium hirsutum)叶枝埋入5种不同微生态系统土壤中,发现140 d后在3种土壤中仍能检测到Bt毒素,含量分别为起始浓度的3%、16%和35%。Donegan等(1997)对转蛋白酶抑制剂基因烟草(Nicotiana tabacum)中蛋白酶抑制剂在土壤中的残留进行了分析,发现含转基因植物叶片的垃圾袋埋入土壤中57 d后仍能检测到0.05%的蛋白酶抑制剂。James(1997)Crecchio等(1998)报道,Bt毒素可通过枯枝落叶和根系分泌物残留在土壤中,与土壤粘粒结合毒性难以降解, 可持续2~3个月。Tapp等(1998)Crecchio等(1998)的研究表明,Bt杀虫蛋白能快速和紧密地与土壤粘粒和腐殖酸结合,其毒性在土壤中滞留期最长达234 d。美国纽约大学Saxena等(1999)用转Bt玉米的根系分泌物饲喂烟草天蛾(Manduca sexta)幼虫,结果发现幼虫停止进食,5 d后死亡率高达95%~100%,而对照组无一死亡。转基因农作物对土壤生态系统的影响的研究,主要集中在对根际微生物数量和种类等方面(王忠华等,2002)。Donegan等(19951996)在研究转Bt棉花和马铃薯根系分泌物对土壤细菌的影响时,发现根际细菌的数量在转基因植物与对照间无显著差异。Oger等(1997)对转基因植物对根际细菌的影响进行了研究,结果发现转基因植物可改变根际细菌的生物学环境。Glandorf等(1997)研究了抗真菌和细菌转基因烟草对腐生型土壤细菌(如菌根和根瘤菌等)的影响,发现抗真菌和细菌蛋白会残留在根际土壤中,从而影响腐生型土壤细菌的数量。钱迎倩等(1998)报道,带有几丁质酶的抗真菌的转基因作物可通过残枝落叶的降解和根系分泌物减少土壤中菌根的种群。转基因林木长期产生大量的枯枝落叶,根际分泌物也长期对根际生物起重要影响。土壤微生物由于活动空间相对狭小,受根际分泌物及枯枝落叶影响较大,是土壤生物系统易受转基因植物影响的敏感生物。

本研究将根系周围微生物划分为细菌、放线菌和真菌3大类,并分别进行计数,对转基因林与非转基因林、转基因植株与非转基因植株根系周围微生物进行了比较,初步证明杨树转基因植株未对微生物3大类群的数量有显著影响。由于森林土壤微生物生态系统组成、结构、功能复杂,系统、全面开展这方面的研究非常必要。本文作为初次的研究报道,还没有对微生物进行更细致的分类,且为一年的研究结果。在此基础上,我们将选定各类微生物的代表种群,进行长时间的跟踪研究。同时,还要开展转基因欧洲黑杨对土壤其它生物影响的研究,获得较全面的转基因树木安全性的基础数据,以评估其大面积释放的安全性。

参考文献(References)
程海鹏, 朱睦元, 金伟, 等. 2001. 植物转基因沉默研究进展. 生物工程进展, 21(6): 47-49. DOI:10.3969/j.issn.1671-8135.2001.06.011
胡建军, 刘庆一, 王克胜, 等. 1999. 欧洲黑杨转Bt基因植株大田抗虫性测定. 林业科学研究, 12(3): 202-205.
林良斌, 官春云, 周小云, 等. 2002. 外源基因在转基因抗虫油菜中的遗传行为. 湖南农业大学学报(自然科学版), 28(2): 100-102.
刘允军, 王国英. 2003. cry1A基因在转基因玉米中的遗传与表达. 植物学报, 45(3): 253-256. DOI:10.3321/j.issn:1672-9072.2003.03.001
钱迎倩, 马克平. 1998. 经遗传修饰生物体的研究进展及其释放后对环境的影响. 生态学报, 18(1): 1-9.
佘建明, 蔡小宁, 朱卫民, 等. 2002. 外源基因在不结球白菜转基因植株后代中的表达. 江苏农业学报, 18(1): 33-36. DOI:10.3969/j.issn.1000-4440.2002.01.007
田颖川, 李太元, 莽克强, 等. 1999. 抗虫转基因欧洲黑杨的培育. 生物工程学报, 9(4): 291-297.
王忠华, 叶庆富, 舒庆尧, 等. 2002. 转基因植物根系分泌物对土壤微生态的影响. 应用生态学报, 13(3): 373-375. DOI:10.3321/j.issn:1001-9332.2002.03.028
姚方印, 朱常香, 李广贤, 等. 2002. Bt水稻的抗虫性鉴定及转基因的遗传分析. 中国农业科学, 35(2): 142-145. DOI:10.3321/j.issn:0578-1752.2002.02.006
Crecchio C, Stotzky G. 1998. Insecticidal activity and biodegradation of the toxin from Bacillus thuringiesis subsp. kurstaki bound to humic acids from soil. Soil Biochem, 30(4): 463-470.
Donegan K K, Palm C J, Fieland V J, et al. 1995. Changes in levels, species and DNA fingerprints of soil microorganisms associated with cotton expressing the Bacillus thuringiensis var. kurstaki endotoxin. Appl Soil Ecol, 2: 111-124. DOI:10.1016/0929-1393(94)00043-7
Donegan K K, Schaller D L, Stone J K, et al. 1996. Microbial populations, fungal species diversity and plant pathogen levels in field plots of potato plants expressing the Bacillus thuringiensis var. tenebrionsis endotoxin. Transgenic Research, 5: 25-35. DOI:10.1007/BF01979919
Donegan K K, Seidler R J, Fieland V J, et al. 1997. Decomposition of genetically engineered tobacco under field conditions: persistence of the proteinase inhibitor I product and effects on soil microbial respi2 ration and protozoa, nematode and microarthropod populations. J Appl Ecol, 34(3): 767-777. DOI:10.2307/2404921
Glandorf D C M, Bakker P A H M, Van Lon L C, et al. 1997. Influence of the production of antibacterial and antifungal proteins by transgenic plants on the saprophytic soil microflora. Acta Bot Neerlandica, 46(1): 85-104. DOI:10.1111/plb.1997.46.1.85
Hu J J, Tian Y C, Han Y F, et al. 2001. Field evaluation of insect-resistant transgenic Populus nigra trees. Euphytica, 121(2): 123-127. DOI:10.1023/A:1012015709363
James R R. 1997. Utilizing a social ethic toward the environment in assessing genetically engineered insect-resistance in trees. Agric Huan Values, 14: 237-249. DOI:10.1023/A:1007408811726
Oger P, Petit, Dessaux Y. 1997. Genetically engineered plants producing opines alter their biological environment. Nature Biotechnol, 15(4): 369-372.
Palm C J, Schaller D L, Donegan K K, et al. 1996. Persistence in soil of transgenic plant produced Bacillus thuringiensis var. kurstaki delta-endotoxin. Can J Microbiol, 42(12): 1258-1262. DOI:10.1139/m96-163
Sala F, Castiglione S, Hu J J et al. Field and molecular evaluation of insect-resistant transgenic poplar (Populus nigra L.) trees. In: Arencibia A D(ed).Plant genetic engineering: towards the third millennium. New York: Elsevier Science, 2000: 137-142
Saxena D, Florest S, Stotzky G. 1999. Insecticidal toxin in root exudates from Bt corn. Nature: 402-480.
Smalla K, Gebhard R, van Isas J D et al. Bacterial communities influenced by transgenic plants and microorganisms. In: Proceedings of the 3rd international Symposiums. Monterey, California, USA, 1994: 157-167
Tapp H, Stotzky G. 1998. Persistence of the insecticidal toxin from Bacillus thuringiensis subsp. kurtaki in soil. Soil Boil Biochem, 30(4): 471-476. DOI:10.1016/S0038-0717(97)00148-X
Wang G J, Stefano C, Chen Y, et al. 1996. Poplar (Populus nigra L.) plants transformed with a Bacillus thuringiensis toxin gene: insecticidal activity and genomic analysis. Transgenic Research, 5: 289-301. DOI:10.1007/BF01968939
Wolfenbarger L L, Phifer P R. 2000. The ecological risks and benefits of genetically engineered plants. Science, 290(5499): 2088-2093. DOI:10.1126/science.290.5499.2088