林业科学  2004, Vol. 40 Issue (5): 99-104   PDF    
0

文章信息

安新民, 张上隆, 徐昌杰, 陶俊, 秦巧平.
An Xinmin, Zhang Shanglong, Xu Changjie, Tao Jun, Qin Qiaoping.
甜橙液泡转化酶基因(CSVI)的分离及全序列分析
Isolation and Characterization of Citrus sinensis Vacuolar Invertase Gene (CSVI)
林业科学, 2004, 40(5): 99-104.
Scientia Silvae Sinicae, 2004, 40(5): 99-104.

文章历史

收稿日期:2003-04-18

作者相关文章

安新民
张上隆
徐昌杰
陶俊
秦巧平

甜橙液泡转化酶基因(CSVI)的分离及全序列分析
安新民1 , 张上隆1 , 徐昌杰1 , 陶俊2 , 秦巧平1     
1. 浙江大学  杭州 310029;
2. 扬州大学  扬州 225009
摘要: 根据不同植物液泡转化酶基因序列的保守区设计合成引物,采用滤纸吸附噬菌体PCR法,首次从甜橙基因组文库筛选出含甜橙液泡转化酶基因的阳性λ噬菌体,经过大量培养并提取其DNA, 限制性内切酶消化后进行DIG southern印迹分析,将阳性条带回收、加工并克隆测序。序列分析表明,该基因全长4 722 bp,编码588个氨基酸,包括6个外显子和5个内含子。在GenBank进行Blast检索的结果表明,该基因编码的氨基酸序列与马铃薯、番茄和酸樱桃液泡转化酶基因编码的氨基酸序列同源性分别为68%、68%和62%。系统进化关系聚类分析结果表明,该基因属液泡转化酶基因类型。该基因已经在GenBank登录(登录号:AF433643)。该基因的获得为从分子水平研究柑桔果实发育过程中蔗糖积累和分解机制以及通过基因工程改良果实品质奠定了基础。
关键词: 甜橙    液泡转化酶    基因分离    
Isolation and Characterization of Citrus sinensis Vacuolar Invertase Gene (CSVI)
An Xinmin1, Zhang Shanglong1, Xu Changjie1, Tao Jun2, Qin Qiaoping1     
1. Zhejiang University  Hangzhou 31002;
2. Yangzhou University  Yangzhou 225009
Abstract: A pair of primers, designed from conserved regions of plant vacuolar invertase genes, was used to screen Citrussinensis vacuolar invertase gene (CSVI) from C.sinensis genomic library. The positive λ phage was isolated by filter paperabsorption phage PCR, and cultured largely. DNA from the positive λ phage was digested with several restriction enzymes. Thepositive fragments judged by DIG southern blotting analysis, were reclaimed, modified, cloned into pUC19 and pUCm-T, andsequenced respectively. The result indicated that the sequence was 4 722 bp including 6 exons and 5 introns, coding 588 amino acids. It was found to have 68%, 68% and 62% homology respectively to Solanum tuberosum (X70368), Lycoperscion esculentam (Z12025) and Prunus cerasus (AY048579) vacuolar invertases by blast analysis in GenBank. Meanwhile, it was subclassed intoplant vacuolar invertase by phylogenetic relation analysis. CSVI had been registered in GenBank (Accession No. AF433643). Thiswork will contribute to a study on the molecular mechanisms of accumulation and catabolism of sucrose during Citrus fruit development, and improvement of Citrus fruit quality by gene engineering.
Key words: Citrus sinensis    Vacuolar invertase    Geneisolation    

蔗糖是植物光合产物的主要贮运形式之一,而转化酶与蔗糖的代谢密切相关,它催化蔗糖分解为果糖和葡萄糖。高等植物的转化酶包括几种同工酶,它们可通过亚细胞定位、溶解性、最适pH值以及等电点(pI)来加以区分。酸性转化酶存在于细胞壁(不溶性的)和液泡(可溶性的)中,中性或碱性转化酶存在于细胞质中(Sturm et al., 1990Kim et al., 2000)。有关研究表明,液泡转化酶参与植物的渗透调节和细胞膨大、调控果实等贮藏器官中糖成份及比例以及对胁迫如寒冷作出响应等生理过程(Woodson et al., 1987Ohyama et al., 1995Klann et al., 1996Zrenner et al., 1996)。

自从Sturm等(1990)从胡萝卜(Daucus carota)中分离出第一个转化酶基因以来,迄今为止,已从甜菜(Beta vulgaris)、马铃薯(Solanum tuberosum)、拟南芥(Arabidopsis thaliana)、烟草(Nicotiana tabacum)、玉米(Zea mays)、番茄(Lycopersicon sculentum)、豌豆(Pisum sativum)、蚕豆(Vicia faba)、绿豆(Vigna radiata)等植物中分离到转化酶基因。就果树而言,则仅从葡萄(Vitis vinifera)(Davies et al., 1996)、草莓(Fragaria ananassa)(AF000521)、酸樱桃(Prunus cerasus)(AY048579)和桃(Prunuspersica)(AF367453)中分离到该基因,在柑桔上安新民等(2001)率先报道了柑桔转化酶基因家族的2个成员并首次在GenBank登录,为研究柑桔果实蔗糖积累与分解的分子机制,本文开展了甜橙(Citrus sinensis)液泡转化酶全长基因的分离工作。

1 材料与方法 1.1 材料 1.1.1 甜橙基因组DNA文库

甜橙基因组文库由陈大明等(2000)构建。

1.1.2 引物

根据植物液泡和细胞酸性转化酶基因的保守区序列设计一对PCR引物如下:上游引物5′TATAACCCGGAGAACGACAAGTG 3′和下游引物5′ACTGTTCTTCCTCCTTGGCCAAA 3′(用于筛选液泡酸性转化酶基因)。

1.1.3 限制性内切酶

SacⅠ,EcoRⅠ,SalⅠ,NdeⅠ,EcoRⅤ,Hind Ⅲ,PstⅠ(购自TaKaRa)。

1.1.4 凝胶DNA回收试剂盒

QIAquickTM Gel Extraction Kit(QIAGEN)。

1.1.5 Southern杂交试剂盒

DIG DNA Labeling and Detection Kit (Roche)。

1.2 方法 1.2.1 PCR反应

50 μL PCR反应体系包括1 μL噬菌体液,各0.2 μmol·L-1上游引物和下游引物,1×PCR反应缓冲液,2 mmol·L-1 MgCl2,200 μmol·L-1 dNTPs和2单位TaqDNA聚合酶。PCR循环条件为94℃预变性5 min,最后72℃延伸10 min,94℃变性40 s,50℃退火40 s,72℃延伸1 min,共进行35轮循环。

1.2.2 甜橙基因组文库的筛选

采用安新民等(2003)改进的滤纸吸附噬菌体-PCR法。

1.2.3 阳性λ噬菌体的培养及其λDNA的提取

参照Sambrook等(1995)的方法。

1.2.4 阳性噬菌体DNA限制性酶切

20 μL反应体系包括15 μL(约5 μg)λ噬菌体DNA、5单位内切酶、2 μL 10×缓冲液和无菌双蒸水,37℃消化过夜。

1.2.5 Southern杂交分析

按照DIG DNA Labeling and Detection Kit(Roche)说明书进行。

1.2.6 甜橙液泡酸性转化酶基因的亚克隆

凝胶中DNA的回收采用QIAquickTM Gel Extraction Kit(QIAGEN)回收凝胶中阳性DNA片段并进行3’末端加工(安新民等, 2003),经加工的酶切产物与pUCm-T载体连接,连接产物转化大肠杆菌TG1菌株感受态细胞,通过蓝白斑筛选、质粒长度和酶切鉴定获得重组质粒(Sambrook et al., 1995)。

1.2.7 DNA序列测定及结果分析

DNA序列委托上海生工生物工程技术服务有限公司测定。DNA序列分析采用Seq Aid Ⅱ和Bioedit软件包进行。

2 结果与分析 2.1 阳性λ噬菌体DNA的酶切

采用安新民等(2003)改进的滤纸吸附噬菌体-PCR法,仅通过4轮共7次PCR反应便从甜橙基因组文库中筛选获得了甜橙液泡转化酶基因的一个阳性λ噬菌体,经过进一步纯化后分离得到甜橙液泡转化酶基因的阳性λ噬菌体单克隆。将获得的阳性λ噬菌体单克隆大量培养,并提取噬菌体DNA。分别用SacⅠ,SacⅠ+EcoRⅠ,SacⅠ+SalⅠ,SacⅠ+NdeⅠ,SacⅠ+EcoRⅤ,HindⅢ,PstⅠ将λ噬菌体DNA(CSVI)进行消化,结果表明用SacⅠ+EcoRⅠ,SacⅠ+SalⅠ,SacⅠ+NdeⅠ,SacⅠ+EcoRⅤ,HindⅢ,PstⅠ消化均获得较多的条带(图 1)。

图 1 阳性λ噬菌体DNA (CSVI)限制性内切酶消化结果 Fig. 1 Postive λ phage DNA digested with restriction enzymes 1. λ DNA/E+H Maker;2~8.分别为阳性λ噬菌体DNA用SacⅠ, SacⅠ +EcoRⅠ, SacⅠ+SalⅠ, SacⅠ+NdeⅠ, SacⅠ+EcoR Ⅴ, HindⅢ, PstⅠ消化结果。Positive λ phage DNA digested with SacⅠ, SacⅠ+EcoRⅠ, SacⅠ+SalⅠ, SacⅠ+NdeⅠ, SacⅠ+EcoRⅤ, HindⅢ, PstⅠ respectively.
2.2 Southern杂交分析

为鉴别酶消化后的阳性条带,将凝胶中的酶消化产物通过20×SSC印迹到尼龙膜,按DIGDNA Labeling and Detection Kit(Roche)说明书进行Southern杂交分析,结果表明,分别采用SacⅠ、HindⅢ、PstⅠ消化后长度分别大约为21 kb和3 kb、4.0 kb和0.7 kb以及5 kb的条带(图 1中第2、7和8泳道,对应图 2中第1、6和7泳道)呈阳性。而分别采用SacⅠ+EcoRⅠ、SacⅠ+SalⅠ、SacⅠ+NdeⅠ、SacⅠ+EcoRⅤ组合消化后,长度分别大约为5 kb和0.5 kb、5 kb和3 kb、5 kb和3 kb、3 kb的条带(图 1中第3~6泳道,对应图 2中第2~5泳道)呈阳性。根据上述酶切和Southern杂交结果,结合探针中的酶切位点以及所采用的亚克隆方法,认为HindⅢ单酶切与SacⅠ和SalⅠ双酶切的阳性条带便于快速分离目的基因全长序列。

图 2 阳性λ噬菌体DNA酶消化后的DIGSouthern Blots分析(箭头所指条带用于回收克隆测序) Fig. 2 DIG Southern Blots of positive λ phage DNA digested with restriction enzymes(fragments arrowed were cloned and sequenced) 1~7:分别为阳性λ噬菌体DNA用SacⅠ, SacⅠ+EcoRⅠ, SacⅠ+SalⅠ, SacⅠ+NdeⅠ, SacⅠ+EcoRⅤ, HindⅢ, PstⅠ消化后Southern印迹。DIG Southern Blots of positive λ phage DNA digested with SacⅠ, SacⅠ+EcoRⅠ, SacⅠ+SalⅠ, SacⅠ+NdeⅠ, SacⅠ+EcoRⅤ, HindⅢ, PstⅠrespectively.
2.3 阳性条带的亚克隆和测序

按照QIAquickTM Gel Extraction Kit(QIAGEN)说明书回收并纯化上述阳性条带(Hind Ⅲ酶切以及SacⅠ和SalⅠ双酶切),采用我们改进的亚克隆方法进行酶切产物修饰后克隆入pUCm-T和pUC19载体。经长度和酶切鉴定获得重组质粒。委托上海生工生物工程技术服务有限公司测序(图 3),该基因全长4 722 bp。

图 3 推测的甜橙液泡转化酶基因(CSVI)全长序列及其编码的氨基酸序列 Fig. 3 The full nueclotide and deduced amino acid sequence of putative vacuolar invertase gene (CSVI) from C.sinensis 小写字母为非编码序列, 大写字母为编码序列。 The small letters belong to non-coding sequence, the capital letters belong to coding sequence.
2.4 基因序列、结构和酶切位点分析

结合真核生物基因组DNA内含子的一般剪切规律,并运用BCM Gene Finder主页(http://dot.imgen.bcm.tmc.edu:933I/gene-finder/gf.html)上的SPL(search for potential splice sites)程序对该序列进行拼接分析,结果表明该基因序列包括6个外显子和5个内含子(upstream sequence 1......94;1stexon 95...... 488;1stintron 489...... 751;2ndexon 752......761;2nd intron 762...... 2375;3rd exon 2376......3232;3rd intron 3233...... 3580;4thexon 3581......3798;4th intron 3799......3886;5th exon 3887......3974;5th intron3975......4083;6thexon4084...... 4281;Down stream sequence 4282......4722)(图 3图 4),编码588个氨基酸(采用Seqaid Ⅱ推导)。拼接位点的位置与其它植物的转化酶基因完全一致,但内含子长度差异较大,该基因的第2个内含子长达1 616 bp。而第2个外显子长仅9 bp,编码3个氨基酸(DPN即天冬氨酸、脯氨酸和天冬酰胺),是迄今为止在植物界发现的最小的外显子。

图 4 甜橙液泡转化酶基因基因结构及酶切物理图谱 Fig. 4 Restriction and structure map of vacuolar invertase gene from C.sinensis B:BglⅠ; E:EcoRⅤ; Ec:EcoRⅠ; H:HindⅢ; Hi:Hinc Ⅱ; K:KpnⅠ; N: NcoⅠ; P: PstⅠ; S:SacⅠ; Sm: SmaⅠ.

运用Seqaid Ⅱ对全序列进行酶切位点分析,发现在序列1762、2397、2528、2683、3406、3591、3624、3682、4104、4242、4575 bp处分别具有NcoⅠ、KpnⅠ、EcoRⅤ、SmaⅠ、HindⅢ、PstⅠ、SacⅠ、BglⅠ、HindⅢ、EcoRⅠ、HincⅡ限制性酶切位点(图 4)。

2.5 序列比较、同源性分析与聚类分析

采用Bioedit和Clustalx对该基因推导的氨基酸序列及温州蜜柑(Citrus unshiu)转化酶基因编码的氨基酸序列进行分析,结果表明二者同源性仅为50.22%,说明CSVI是柑桔转化酶基因家族的一个新的成员。序列中的“NDPNG”和“MWECVD”(图 5)分别为植物转化酶非常保守的2个基序(motif),它们在转化酶的结构和催化活性上具有重要的功能(Kim et al., 2000)。在GenBank进行Blast检索,结果表明该基因编码的氨基酸与马铃薯(Solanum tuberosum, X70368)、番茄(Lycoperscion esculentam, Z1 2025)和酸樱桃(Prunus cerasus, AY048579)液泡转化酶基因编码的氨基酸序列同源性分别为68%、68%和62%。

图 5 甜橙液泡转化酶基因(CSVI, AF433643)和温州蜜柑转化酶基因(CitINV1, AB074885)编码的氨基酸序列比较 Fig. 5 Comparison of protein sequences deduced from C.sinensis vacuolar invertase (CSVI, AF433643) andC. unshiu invertase(CitINV1, AB074885) genes 氨基酸序列用1个字母表示, 并采用Clustal W软件引入(--)以达到最大的同源性;保守的β-果糖苷酶基序(NDPNG)和半胱氨酸催化位点(MWECVD)用框粗体字母表示; 完全保守和适当替代的氨基酸分别用*和.表示。 The amino acid sequences are in the one-letter code and have been aligned by introducing gaps (--) to maximize homology (Clustal W software); Conserved β-fructosidase motifs (NDPNG) cysteine catalytic sites (MWECVD) are shown in boxed bold letters; Totally conserved and conservatively replaced amino acids are indicated by asterisks and dots, respectively.

运用Clustalx对转化酶氨基酸序列进行比较并绘制了系统进化关系聚类树(图 6)。不考虑单子叶或双子叶植物起源,植物的转化酶分为细胞壁和液泡转化酶2类,明显区别于细菌和酵母转化酶。甜橙液泡转化酶基因(CSVI)编码的氨基酸序列在进化关系中属于液泡转化酶,而与细胞壁转化酶关系较远,并且它与温州蜜柑转化酶(CitINV1,AB074885)分属柑桔液泡转化酶基因家族的2个不同成员。证实了植物进化过程中在细胞壁和液泡转化酶基因之间的歧化先于物种的多样化这一观点(Kim et al., 2000)。

图 6 转化酶蛋白序列的系统进化关系 Fig. 6 Phylogenetic relation of invertase protein sequences Atbfruct1, Atbfruct2, Atbfruct3, Atbfruct4(X74514, U11033, X95537, X97749):拟南芥Arabidopsis; VfVCINV, VfCWINV2(Z49831, Z35163):蚕豆Vicia faba; InvDC1, InvDC2, sI, sII (M58362, X78424, X75352, X67163):胡萝卜Daucus carota; Ivr1, Incw1, Incw2, Incw3 (U16123, U17695, AF050631, AF043346):玉米Zea mays; pCD141, pPAl11(Z22645, L29099):马铃薯Solanum tuberosum; PcI (X85327):豌豆Pisum sativum; CWI (X8 1834):烟草Nicotiana tabacum; AI(D10265):绿豆Vigna radiata; InvLe23g(Z1 2025):番茄Lycopersicon sculentum; Sxy (X67744):葡萄球菌Staphylococcus xylosus; Val (M26511):弧菌Vibrio alginolyticus; Ppe (L3 2093):足球菌Pediococcus pentasaceus; Eco (X81461):大肠杆菌Escherichia coli; Bsu (X73124):杆状菌Bacillus subtilis; Suc2(Z46921):酵母菌Saccharomyces cerevisiae.
3 讨论与小结

植物的转化酶存在几种同工型,依据其亚细胞定位可分为液泡、细胞壁和细胞质转化酶3种类型。果实等库器官液泡中转化酶活性的高低决定糖分组成及蔗糖与己糖的比例,并且通过调节渗透溶质来实现对库强的调控。Klann等(1996)研究发现,在番茄果实发育期间(直至最后一周),酸性转化酶反义基因转化的果实中蔗糖含量约为对照的5倍,而葡萄糖和果糖则只有50%,而果实则比对照小30%。这表明番茄果实的糖分组成和大小受液泡转化酶水平的调控。Tang等(1999)研究表明,液泡转化酶反义基因转化抑制了胡萝卜直根的发育而促进叶片增多,使叶/根比提高到1.5:1(对照植株为1:3)。由此可见,液泡转化酶对果实品质形成和产量至关重要。

本研究采用滤纸吸附噬菌体PCR法从甜橙基因组文库中筛选并分离了甜橙转化酶基因家族的一个成员(CSVI),并率先在GenBank登录(登录号为AF433643)。序列分析表明,该基因序列全长4 722 bp,编码588个氨基酸,包括6个外显子和5个内含子。其中第2个外显子仅9 bp,编码DPN(天冬氨酸、脯氨酸和天冬酰胺),是迄今为止在植物中发现的最小外显子。它与另一段保守序列“MWECVD”是植物转化酶中非常保守的2个基序。同源性分析结果表明它与定位于液泡的转化酶基因同源性较高,与马铃薯(X70368)、番茄(Z1 2025)和酸樱桃(AY048579)液泡转化酶基因编码的氨基酸序列同源性分别为68%、68%和62%。进一步的系统进化关系聚类分析结果表明,该序列属于液泡转化酶基因。这种结构和序列的高度保守性和相似性,使我们有理由推测功能上的相似性。

该基因的获得将为通过基因过程手段定向改良柑桔等果树果实品质奠定了基础,并且对于研究柑桔果实发育过程中蔗糖积累和分解的分子机制具有重要的意义。另一方面,编码液泡转化酶的基因可能存在若干成员,其它成员的分离工作有待进一步进行。

参考文献(References)
安新民, 徐昌杰, 张上隆. 2001. 柑桔酸性转化酶基因片段的克隆. 果树学报, 18(4): 189-193.
安新民, 徐昌杰, 张上隆, 等. 2003. 应用滤纸吸附-PCR法和改进的亚克隆方法快速筛选克隆甜橙细胞壁酸性转化酶基因(CS-CWI). 细胞生物学杂志, 25(1): 59-62.
陈大明, 徐昌杰, 张上隆. 2000. 脐橙基因组DNA文库的构建. 园艺学报, 27(6): 401-405. DOI:10.3321/j.issn:0513-353X.2000.06.003
Sambrook J, Fritsch E F, Maniatis T著.金冬雁, 黎孟枫等译.分子克隆实验指南.第二版.北京: 科学出版社, 1995
Davies C, Robinson S R. 1996. Sugar accumulation in grape berries: Cloning of two putative vacuolar invertase cDNAs and their expression in grapevine tissues. Plant Physiol, 111: 275-283. DOI:10.1104/pp.111.1.275
Kim J Y, Aline M, Sylvain G, et al. 2000. Characterization of two members of the maize gene family, Incw3 and incw4, encoing cell-wall invertases. Gene, 245: 89-102. DOI:10.1016/S0378-1119(00)00034-2
Klann E M, Bradford H, Alan B B. 1996. Antisense acid invertase (TIV1) gene alters soluble sugar composition and size in transgenic tomato fruit. Plant Physiol, 112: 1231-1330.
Ohyama A, Ito H, Sato T, et al. 1995. Suppression of acid invertase activity by antisense RNA modifies the sugar composition of tomato fruit. Plant Cell Physiol, 36(2): 369-376. DOI:10.1093/oxfordjournals.pcp.a078769
Sturm A, Chrispeels M. 1990. cDNA cloning of carrot extracellular β-fructosidase and its expression in response to wounding and bacterial infection. Plant Cell, 2: 1107-1119.
Tang G Q, Luscher M, Sturm A. 1999. Antisense repression of vacuolar and cell wall invertase in transgenic carrot alters early plant development and sucrose partitioning. The Plant Cell, 11(2): 177-189. DOI:10.1105/tpc.11.2.177
Woodson W R, Wang H. 1987. Invertases of carnation petals, partial purification, characterization and changes in activity during petal growth. Plant Physiol, 71: 224-228. DOI:10.1111/j.1399-3054.1987.tb02872.x
Zrenner R, Schüler K, Sonnewald U. 1996. Soluble acid invertase determines the hexose-to-sucrose ratio in cold-stored potato tubers. Planta, 198: 246-252.