松材线虫病是由松材线虫(Bursaphelenchus xylophilus)引起的松树萎蔫性病害，近年来在我国发生蔓延迅速，病死率高，严重威胁我国松属植物特别是南方地区乡土树种马尾松(Pinus massoniana)的安全(朱克恭等, 1995)。该病的病理机制尚未完全明确，20世纪70年代以来，线虫的病原性逐步得到证实，但由于病树的生理学和组织学的病变发生在线虫数量增长之前，所以一般认为线虫以外的其它致病物质可能参与了病理活动。现在，线虫携带的细菌参与病理活动并最终导致了病害的发生与松树的死亡得到越来越多的证实，Oku等(1980)推测松材线虫病的发生时存在的毒性物质可能与细菌有关，Kusunoki (1987)观察到病组织的树脂道内和薄壁组织中存在大量细菌，Kawazu等(1996)从松材线虫中分离了3种芽孢杆菌¹⁾，并提取了由这些细菌产生的毒性物质，赵博光等(2000a)证实线虫与细菌复合侵染造成了病害的发生，而且还用电子显微镜和普通光学显微镜观察到线虫携带的细菌(赵博光等, 2000b; 谢立群等, 2002)。为了进一步探讨病树体内线虫和细菌的变化规律，笔者对松材线虫病发生过程中病树体内细菌种群数量的变化动态进行了研究。

1) Kawazu K, Kaneko N, Kanzaki H. What factors govern the pathogenicity of the pine wood nematode, Bursaphelenchus xylophilus? In: Sustainability of pine forests in relation to pine wilt and decline, Proceedings of international symposium. Tokyo, Oct. 27-28, 1998

1 材料与方法 1.1 供试线虫和松树

供试线虫：2002年4月从南京地区10~15 a生黑松(P. thunbergii)病死木上采用贝曼漏斗法(方中达, 1998)分离，置线虫悬浊液于10 mL离心管中，1500 r·min^-1离心3 min，除去上清液，无菌水洗涤线虫3次，每次洗涤后均离心浓缩，为确保线虫的纯度，避免其它线虫混入，在体视显微镜下，挑取松材线虫数10条接入预先准备的在马铃薯-蔗糖-琼脂(PDA)的培养基上长满灰葡萄孢霉(Botrytis cinerea)的培养皿(Φ8 cm)中培养，待线虫将灰葡萄孢霉的疏松菌丝层全部取食，培养皿内线虫大量增殖(约10 d)后，备用。

试验样地：设在南京市伊刘苗圃，人工种植的6~7 a生黑松生长于丘陵小坡地上，坡向东北，部分地表生长有杂草，栽植密度为300株·(667m²)^-1，长势良好。

接种方法：接种时间为2002年5月4日。选择2 a生枝条作为接种枝，直径8~10 mm左右，在拟接种处松枝用含75%酒精的棉球擦试表面，剪去接种点上部枝条，套上经预先消毒的长8 cm的橡皮管(Φ5 mm)，套入深度约2 cm，在橡皮管中接入线虫悬浮液0.5 mL，橡皮管上端用灭菌的封口膜密封以防水分迅速蒸发，每株接种数量分别为5 000条和1 000条，各接种5株，编号分别为1~5和6~10。同时设置对照组，对照组1采用相同的方法接种松树2株，各接入灭菌水0.5 mL，对照组2为不作处理的外观健康的松树。

1.2 试验内容 1.2.1 病树症状的观察

病树流脂观察(Kiyohara et al., 1975; 刘伟等, 1998)：从5月14日起5 d 1次在树木的主干距地面30 cm处用打孔器打孔，24 h后观察流脂情况，打孔器每次打孔前后均用75%酒精消毒，至流脂停止为止。病树症状观察：从5月14日开始每5 d、7月8日起每10 d观察1次发病进程，直至病树完全枯死，全株没有任何绿色针叶为止，由于在不同条件下，病树症状的发展不尽相同，为了方便观察和记述，笔者根据本试验所观察到的病树情况，将发病进程的划分为6个不同的阶段:第1阶段：外观健康，松脂分泌正常；第2阶段：外观健康，松脂分泌明显减少或停止，近接种点附近有少量松针褪色、萎蔫；第3阶段：松脂分泌完全停止。部分针叶失去光泽成灰绿色，与接种枝相近的部分枝条出现少量黄色针叶；主干出现黄色至褐色针叶，其余正常；第4阶段：顶梢及其它1 a生嫩枝仅基部偶见黄色针叶，其余枝条上出现部分黄色针叶，其它针叶失去光泽；第5阶段：顶梢及1 a生嫩枝成灰绿色、萎蔫，部分针叶黄绿色，多年生枝条大多无绿色针叶；第6阶段：顶梢大部或基本枯黄，其余枝条完全枯死，较早枯黄的针叶转褐色，但枝干材质尚松软。

1.2.2 线虫数量变化的测定

根据不同的发病阶段和症状特点，在非接种枝的2~3 a生枝条中部上取样，调查病树体内线虫的数量、细菌的相对数量和种类，每次取样时同时用对照组或未经处理的生长健康的黑松作为对照。称取3 g中部枝条，剪成约2 cm长，火柴梗大小，用贝曼漏斗法分离线虫并计数，计算每g木材中线虫数量，每处理重复3次。

1.2.3 细菌数量变化的测定

剪取非接种枝2~3 a生枝条长20 cm，用含75%酒精的棉球擦试表面，在无菌条件下用灭菌刀具削去树皮，并剪去两端长约2 cm，取中间干净部分用灭菌刀剪切成火柴梗大小的木材组织，采用以下2种方法测定松木组织中细菌的相对数量。

组织块法测定木块带菌率：将上述处理的木材组织剪成0.5 cm长的小块，移入牛肉膏-蛋白胨-琼脂(NB)平板(Φ8 cm)上，每个平板移入组织块8~11块不等，每个处理3个平板，统计木块组织的细菌检出率。

平板法计数法测定细菌数量：灭菌镊子固定木材组织，再用灭菌解剖刀刨削木块成薄片，将薄木片置于无菌的培养皿中，称取1 g，加入到预先准备的5mL生理盐水(含NaCl 8.5 g·L ^-1)的试管(Φ8 mm)中，剧烈振荡5 min，浸泡10 min后，用无菌的移液管取0.5 mL加入到4.5 mL生理盐水的试管中，稀释成系列浓度，分别为原液、10^-1和10^-2稀释液，由于在病树第5~6阶段细菌数量较多，则根据需要增加10^-3和10^-4稀释倍数，每种浓度取0.5 mL于无菌培养皿中，随后倒入融化后冷却至45℃的营养肉汤琼脂培养基(NB)中，28℃培养72 h，统计菌落数量，每种浓度设置3个重复。

1.2.4 细菌种类鉴定

将分离得到的细菌经纯化后，观察菌落的培养性状，并进行革兰氏染色，并观察细菌菌体形态、排列及大小等一般情况，进行氧化酶试验和接触酶试验(东秀珠等, 2001)，根据结果分组，采用API自动鉴定系统(ATB Expression生物-梅里埃Bio-Merieux公司)鉴定细菌的种类。

挑取纯化后的细菌菌落，用2 mL的生理盐水制成菌悬液，在ATB浊度计中调整至一定浊度，根据不同的试条要求，加入相应培养基或试剂后，混匀，将一定量的混合液加入试条的各反应孔中，加盖，30℃下培养24 h或48 h, 用ATB仪自动检测生长情况，读取结果，计算机通过ATB Plus软件分析得到相应结果。

2 结果与分析 2.1 病树体内线虫数量的变化 2.1.1 接种枝上线虫的数量

取外观正常，松脂分泌刚出现减少的松树，在接种枝上剪除离接种点一端5 cm后，取靠端部一侧12 cm，平均截成3段，分离线虫，结果列于表 1。从表 1可见，至松脂分泌异常时，线虫在病树体内已经定殖，同时，观察发现，此时线虫有1/2左右为初龄幼虫，表明线虫已经开始在树体内繁殖。随后的调查还表明，这2株被剪除接种枝的松树此后与其它接种线虫的一样出现发病症状。

2.1.2 非接种枝上线虫的数量

在处于不同发病阶段病树的非接种枝上取样，统计线虫总量，换算成每克木材的线虫数量，整理成图 1，从图 1可以看出，在发病初期的第1和第3阶段，从5月14日至5月29日间的不同接种样树上的多次取样分离中，均未见线虫；直到第4阶段，才见少量线虫，平均为6.8(标准差8.8)，样本间差异较大，第5阶段，线虫数量呈迅速增加至54条(标准差25)，而当病树已大部或完全萎蔫时，线虫数量可达582条(标准差165)，同时从各组数值的标准差可以看出，同一阶段中线虫数量存在一定的差异，这是可能是由于松树的不同部位的枝条，线虫数量不同，同时由于线虫处在数量迅速增长的阶段，从而造成处理间的差异较大。

2.2 非接种枝内细菌数量的变化

采用组织块法测定取自非接种枝上的木块带菌率，在不同的发病情况下木块细菌检出率总体上随病程的发展而增加，变化的动态如图 2，从图中可以看出，初期至中期，病树体内没有或很少检测到细菌，至第3阶段，检出率也仅为3.1%；到发病后期，木材组织带菌率迅速增加，而这时病树已基本萎蔫，或仅剩1 a生枝条上有少量绿色针叶或全无绿色针叶，这时细菌检出率可达96.9%(标准差3.2)，这种带菌率增长的趋势与线虫数量增加的趋势一致，同时在第5阶段，细菌检出率在不同处理间的差异较大，正是细菌数量正在迅速增长引起的。

平板法计数法测定病树在不同的发病情况下细菌的相对数量，根据平板上菌落的不同数量，取每个平板上菌落数小于300的稀释度统计数量，再换算成1 g木材组织中细菌的数量，因此，这是在一定重量的木材组织中，细菌总量的相对值。细菌数量的变化动态如表 2，从表中可以看出，病树体内细菌数量随着病树症状的发展而变化，初期至中期，病树体内没有或很少检测到细菌，平均细菌数为16.7和102，直至发病中后期，细菌数量急剧增长至4.1×10⁴，这种增长趋势与线虫数量增加的趋势一致。在发病中后期，细菌数量变化较大，特别是同一阶段中，不同样本间差异较大，标准差可达到2.6×10⁴，正说明了细菌数量处于增长状态，另外还有一种可能是细菌在树体内分布不是十分均匀。同时，试验发现，在菌落数量较少的处理中，如果存在线虫爬动，则细菌菌落数量明显较多。另外，至发病第5阶段，平板上偶见真菌菌落，第6阶段，个别处理上真菌菌落相对较多，但这种情况并不普遍出现。

2.3 非接种枝内细菌种群数量及变化动态

对从不同发病阶段的病树非接种枝上的细菌分离中，取出现菌落的最大稀释度的平板上菌落数为1~5个的全部菌落或随机挑取，得30个细菌菌株，根据形态观察、革兰氏染色、氧化酶和接触酶试验的结果，进行分组鉴定，鉴定结果见表 3。从总体上看，优势菌群主要为假单胞菌(Pseudomonas sp.)、泛菌属(Pantoeu sp.)和少动鞘氨醇单胞杆菌(Sphim gomenas pancimobilis), 分别占总细菌种数的56.7%、23.3%和13.3%。由于分离菌为某个稀释度平板上出现的所有菌株，而非任意挑取的菌落，分离的菌株在一定程度上可以反映树体内细菌种类组成。从不同的阶段中的细菌的种类组成及变化(表 4)可以看出，随着病程的发展，不但细菌数量迅速增加，同时种类也日趋复杂，在明显出现症状时，细菌种类主要为假单胞菌属和泛菌属的一些种类，至病树基本枯死和完全死亡止，除了假单胞菌属和泛菌属外，还有肠杆菌科的一些种类，细菌菌相变化明显。

3 小结与讨论

树木的萎蔫性病害中，裸子植物远比被子植物少见得多，至今松树上的萎蔫性病害已报道仅有两种，一种是由真菌蓝变菌(Ceratocystis sp.)引起的，另一种是松材线虫，两者均由昆虫为害引发(Mamiya, 1983)。松材线虫病的发病过程和症状表现出特殊性，虽然人们对其病理机制作了大量的研究，但目前尚存在着许多不同的认识。在证实松材线虫病是由线虫和细菌共同侵染造成的基础上，为了进一步了解松材线虫病发生过程中，树体内病原的变化动态，本文首次对病害的发病进程中细菌的种类和种群的变化动态进行了研究。

关于松树受害后树脂分泌停止这一现象，早在发现松材线虫病的病原之前，人们就发现了初夏松树树脂分泌减少与树木在秋季死亡之间的关系，Mamiya (1980)的接种实验证实松树大多在接种14~20 d后，树脂分泌停止20~30 d后，病树枝叶出现蒸腾作用停止的现象，刘伟等(1998)将松树树脂分泌异常用于松材线虫病的早期诊断中，认为20~30 a黑松在春季接种后14 d，可以松脂分泌明显减少作为早期诊断的指标，本试验观察与上述试验结果相比，松脂分泌明显减少出现时间稍晚，可能是由于当年5月上中旬阴雨时间长、气温较常年偏低以及接种树龄不同等原因造成的。

尽管松材线虫早在百年前发现，但当时并不知道它是一种病原，近30 a来，线虫的病原性才逐步得到证实，明确松材线虫为松材线虫病的病原，Kiyohara等(1975)认为在线虫侵染早期，大部分入侵线虫分布在侵染点周围，接种3 d后接种枝上线虫数量明显减少，可能是由于部分线虫没有进入组织仍然停留在树枝表面致使线虫死亡。本试验表明，在松树主干上松脂分泌刚出现减少的现象时，接种枝上已经出现比例较高的线虫幼虫；同时，线虫在出现明显症状后才开始增殖，到病树濒死时才开始急剧增长。

与线虫增长在非接种枝内情况相似，非接种枝内细菌在树脂分泌停止后才开始出现，根据刘伟等(1998)关于松材线虫病早期诊断的方法，这时的供试松树实际上都将在以后萎蔫和死亡，而此时检出的细菌为荧光假单胞菌和假单胞菌/不动杆菌，这说明引起松材线虫病的细菌比较单一，可能仅与假单胞菌属的几种细菌有关。另外，用从黑松病死木上的松材线虫分离的细菌对黑松无菌苗生测证实细菌与线虫一起导致黑松的萎蔫和死亡(赵博光等，2000a)，同时，这些经生测验证有致病作用的细菌种类与我们从本次试验中松树发病初期分离的细菌种类相一致，这进一步说明松材线虫病可能是由线虫和细菌复合侵染引起的。

在病树树脂分泌停止不久，细菌即可在非接种枝内有检出，未见线虫，这可能是由于细菌比线虫在树体内易于移动，更可能的情况是因为细菌数量多，检出的机率比线虫高，结合笔者用松枝的酒精和水的浸提液加入NB培养基中分别培养来自木材的线虫携带的细菌和来自松墨天牛(Monochamus alternatus)的线虫携带的细菌，细菌基本不能生长这一情况，以及单独将多种上述生测证明对黑松苗和黑松愈伤组织有致病作用的细菌分别接种至5 a生松苗均不能使松树发病的事实，说明这些细菌不能单独从伤口入侵并在健康的松树组织中生存，至少在发病的初期线虫大量增殖前如此，这表明细菌与线虫间应当存在协同关系；另一方面，发病中后期，线虫数量剧增，同时细菌不但种群数量呈爆炸式增长，而且种类也变得多样化，说明此时病树体内的环境十分有利于松材线虫的繁殖，同时致病细菌也得到相应的大量繁殖的机会，引起树体内细菌区系的急剧变化。