蔗糖是植物光合产物运转和贮藏的主要形式。许多研究证实, 转化酶(蔗糖酶)催化蔗糖水解生成葡萄糖与果糖，在蔗糖代谢中起着重要作用。转化酶分为酸性、中性或碱性。酸性转化酶存在于细胞壁(不溶性)和液泡(可溶性)中, 中性或碱性转化酶存在于细胞质中。转化酶的活性高低直接决定了组织库强度(Klann et al., 1992), 从而影响光合产物的运转，进而影响作物生长发育。有关番茄(Lycopersicon esculentum)和胡萝卜(Daucus carota)等作物转化酶基因转化植株的研究表明，转化酶活性的改变影响植株光合能力、光合产物的运转分配乃至植株生长、果实大小、品质、产量和育性(Ohyama et al., 1995; 1999; Klann et al., 1996; Scholes et al., 1996; Tang et al., 1999)。

转化酶基因的研究也取得较大进展。目前已在甜菜(Beta vulgaris)、马铃薯(Solanum tuberosum)、拟南芥(Arabidopsis thaliana)、烟草(Nicotiana tabacum)、玉米(Zea mays)、胡萝卜、番茄以及绿豆(Vigna rabiata)等植物上分离了该基因, 但就果树而言，只有葡萄(Vitis vinifera)(Davies et al., 1996)、草莓(Fragaria ananassa) (GenBank登记号AF000521)。安新民等(2001)分离了柑桔(Citrus)转化酶基因家族的2个成员并在GenBank中登记(AF014925和AF314197)。本文报道了获得该基因家族的另外2个新成员CUAI2和CUCWI(登记号分别为AY029481和AF332881)的过程，并对所获得的4个成员的序列特性进行分析。这对于进一步研究它们的时空表达特性，探讨柑桔果实发育过程中蔗糖积累和分解机理具有重要意义。

1 材料与方法 1.1 材料 1.1.1 植物材料

以温州蜜柑(Citrus unshiu)幼叶为提取基因组DNA的材料。

1.1.2 引物

根据GenBank登记液泡转化酶基因(AF465613 Lycopersicon esculentum., AF019113 Oryza sativa., AY037938 Ipomoea batatas., X70368 Solanum tuberosum., U87849 Capsicum annuum., X75353、X75352、X75351、X18707 Daucus carota., AJ277455 Beta vulgaris)和细胞壁转化酶基因(AF000251 Fragaria ananassa., X85327、AF063246 Pisum sativum., Z35163 Vicia faba., AF091549 Hamamelis virginiana., AF434727 Fortunella crassifolia., AP001307、X74514、X74515、AY045776 Arabidopsis thaliana)序列的保守区分别设计下列2对引物:

FP A: 5′ GGATGGTACCATCTGTTCTATC 3′; RP A: 5′ TGACTTCGATGCATAGTATCTC 3′;

FP B: 5′ TACCATCTATTCTACCAGTACAA 3′; RP B: 5′ AAAAAATCAGGACACTCCCACAT 3′。

1.1.3 Southern杂交试剂盒

DIG DNA Labeling and Detection Kit (购自Roche公司)。

1.2 方法 1.2.1 基因组DNA提取

参照陈大明等(1997)的方法。

1.2.2 PCR反应

在HYBAID PCR EXPRESS中进行。反应A:50 μL PCR反应体系包括50 ng温州蜜柑基因组DNA，各0.2 μmol·L^-1上游引物A和下游引物A，1×PCR反应缓冲液，2 mmol·L^-1 MgCl₂，200 μmol·L^-1 dNTPs和2单位Taq DNA聚合酶(购自上海生工)。PCR循环条件为94℃预变性3 min，最后72℃延伸10 min，94℃变性45 s，48℃退火90 s，72℃延伸90 s，共进行35轮循环。反应B: 50 μL PCR反应体系包括50 ng温州蜜柑基因组DNA，0.2 μmol·L^-1上游引物B和下游引物B，1×PCR反应缓冲液，2 mmol·L^-1 MgCl₂，200 μmol·L^-1 dNTPs和2单位Taq DNA聚合酶(购自上海生工)。PCR循环条件为94℃预变性5 min，最后72℃延伸10 min，94℃变性40 s，50℃退火40 s，72℃延伸1 min，共进行35轮循环。

1.2.3 DNA片段重组入质粒载体

PCR产物A和产物B经纯化后分别与pUCm-T(购自上海生工)载体连接, 连接产物转化大肠杆菌TG1菌株感受态细胞，通过蓝白斑筛选、质粒长度和酶切(采用PstⅠ进行酶切)鉴定获得重组质粒(Sambrook et al., 1989)。

1.2.4 DNA序列测定

由上海基因有限公司晶泰测序部测定。

1.2.5 序列分析

采用Seqaid Ⅱ、Clustalx和Bioedit等软件进行分析。

1.2.6 Southern Blots分析

按照DIG DNA Labeling and Detection Kit (Roche)说明书进行。

2 结果与分析 2.1 PCR产物的扩增和克隆

以温州蜜柑基因组DNA为模板，用所设计的2对引物进行PCR反应，得到长度分别大约为740 bp和530 bp的2条带，将PCR产物A和B经纯化后分别与pUCm-T载体连接，连接产物分别转化大肠杆菌TG1菌株感受态细胞，在含氨苄青霉素、X-gal及IPTG的LB平板上涂布获得白色菌落，挑取这些菌落培养、提取质粒，经长度和酶切(PstⅠ)鉴定获得重组质粒A和B。

2.2 基因序列与同源性分析

测定重组质粒A和B的序列，表明2个基因片段长分别为741 bp和524 bp，在GenBank中进行Blast结果表明, 2片段分别属于温州蜜柑液泡酸性转化酶基因、细胞壁酸性转化酶基因。基因片段A长741 bp，属于温州蜜柑液泡酸性转化酶基因开放阅读框的一部分，不含内含子。其序列如图 1。在GenBank中进行同源性检索, 结果表明, 该基因片段序列与番茄(AF465613)、水稻(Oryza sativa, AF019113)、马铃薯(X70368)液泡转化酶基因的同源性分别为80%、83%和81%。该基因编码的氨基酸序列与胡萝卜(X75353)、马铃薯(X70368)和番茄(Z1 2025)液泡酸性转化酶基因编码的氨基酸同源性分别为79%、79%和78%。推测该基因定位于液泡。基因片段B长524 bp，属温州蜜柑细胞壁酸性转化酶基因开放阅读框的一部分，不含内含子。其序列如图 2。在GenBank中进行同源性检索, 结果表明, 该基因片段序列与甜橙(Citrus sinensi., AF314197)、Lotus japonicus (AP004521)和金缕梅(Hamamelis virginian., AF091550)细胞壁转化酶基因的同源性分别为80%、80%和80%, 该基因氨基酸序列与草莓(AF000521)、拟南芥(AP001307)和豌豆(Pisum sativum, AF063246)细胞壁转化酶基因编码的同源性分别为78%、78%和77%。推测该基因定位于细胞壁。

运用Clustalx和Bioedit软件包将获得的7个柑桔酸性转化酶基因(AF014925, AF434728, AY029481, AF433643, AF332881, AF314197, AF434727)推导的氨基酸序列进行聚类和同源性分析，结果表明7个基因序列分属4种酸性转化酶基因类型, AF014925(温州蜜柑)和AF434728(代代酸橙C. aurantium)属液泡Ⅰ型，AY029481(温州蜜柑)和AF433643(甜橙)属液泡Ⅱ型，AF332881(温州蜜柑)属细胞壁Ⅰ型, AF314197(甜橙)和AF434727(金柑Fortunella crassifolia)属细胞壁Ⅱ型(图 3)。同源性分析结果表明基因片段A和B不同于已经获得的柑桔转化酶基因家族的2个成员(CUAI1和CSCWI)(安新民等，2001)。A与CUAI1和CSCWI核酸序列同源性分别为67.21%和58.59%，氨基酸序列同源性分别为70.33%和52.30%(表 1)。推测该基因属于柑桔液泡酸性转化酶基因Ⅱ型(CUAI2)。B与CUAI1和CSCWI 核酸序列同源性分别为56.30%和80.92%，氨基酸序列同源性分别为51.15%和74. 71%(表 1)，推测该基因属于柑桔细胞壁酸性转化酶基因Ⅱ型(CUCWI)。以上结果表明已经获得了柑桔转化酶基因家族成员的4种类型。

2.3 Southern杂交分析 2.3.1 探针标记效率的检测

将经过DIG标记20 h的对照DNA和4个成员的探针分别按1:10², 1:330, 1:10³, 1:10 ⁴, 1:10⁵, 1:10⁶进行梯度稀释，按浓度梯度各取1 μL依次点样于尼龙膜上进行DIG标记效率检测。检测结果表明, CUAI1、CUAI2、CUCWI和CSCWI均获得了较理想的标记效率，与对照DNA的标记效率为同一数量级，达30 ng·μL^-1(图 4)，用于Southern杂交分析时可获得理想的印迹效果。

2.3.2 Southern杂交分析

分别按照CUAI1、CUAI2、CUCWI和CSCWI 4个成员的顺序各取0.5 μg相应的重组质粒DNA依次点样于每条尼龙膜上，用混有DIG标记的CUAI1、CUAI2、CUCWI和CSCWI 4个成员DNA探针的杂交液分别杂交4条尼龙膜。结果表明，CUAI1和CUAI2两个探针分别只与相应的重组质粒DNA出现杂交印迹，而CUCWI和CSCWI两个探针则除各自与相应的重组质粒DNA出现杂交主信号外，同时由于二者80.92%的核苷酸同源性出现杂交次信号(图 5)。说明3个探针间(CUAI1、CUAI2以及CUCWI和CSCWI二者之一)不会出现杂交干扰现象，而CUCWI和CSCW两个探针杂交有时会出现次信号，可通过改用CSCWI序列的上游或下游部分制作探针来消除干扰信号。经过试验后表明，适当地提高杂交温度和洗膜的严紧度也可降低甚至消除CUCWI和CSCWI的杂交干扰。

3 结论与讨论

转化酶水解蔗糖为葡萄糖和果糖，与蔗糖代谢密切相关。转化酶活性的高低直接影响组织库强，进而影响植株的生长发育乃至产量品质的形成。根据转化酶催化的最适pH可将其分为酸性转化酶和碱性转化酶(包括近中性的转化酶)，酸性转化酶一般定位于细胞壁(不溶性的)及液泡(可溶性的), 而碱性转化酶则定位于细胞质(Sturm et al., 1990)。转化酶基因是一个多成员的基因家族, 不同定位的转化酶同工型由几个不同的基因成员编码。在玉米中已分离到4个不同的细胞壁转化酶基因成员(INCW1 U17695, INCW2 AF050631, INCW3 AF043346, INCW4 AF043347)和1个液泡转化酶基因(Ivr1 U16123)(Kim et al., 2000)。在胡萝卜转化酶基因家族中，编码细胞壁酸性转化酶基因的5个不同成员(X69321, X78423, X78424, X18706, X18707)和编码液泡酸性转化酶基因的4个不同成员(X67163, X75351, X75352, X75353)以及编码中性转化酶的1个基因均已得到分离(Lorenz et al., 1995; Sturm, 1996; Sturm et al., 1999)。

柑桔转化酶基因也是一个多成员基因家族，已经报道了2个转化酶基因成员(柑桔液泡酸性转化酶基因Ⅰ型CUAI1和柑桔细胞壁酸性转化酶基因Ⅱ型CSCWI，GenBank登记号分别为AF014925和AF314197)(安新民等，2001)。本研究获得了柑桔可溶性酸性转化酶基因家族的另外2个成员柑桔液泡酸性转化酶基因Ⅱ型(CUAI2)和柑桔细胞壁酸性转化酶基因Ⅱ型(CUCWI)，已经在GenBank登记(AY029481和AF332881)。

对已获得的7个柑桔转化酶基因的聚类和同源性分析表明：(1)柑桔酸性转化酶基因家族至少有4个成员，而且2个新成员与CUAI1和CSCWI分属酸性转化酶基因家族的4个不同的成员。(2)柑桔属不同种和品种之间同一成员差异极小，因此推测4个成员的探针通用于柑桔属不同种和品种的Southern、Northern和Western杂交分析。(3)Southern杂交分析表明CUAI1、CUAI2、CUCWI 3个成员杂交时不会产生相互干扰的信号，CUAI1、CUAI2、CSCWI 3个成员杂交时也不会产生相互干扰的信号，CUCWI和CSCWI之间的交叉干扰现象是由于二者核酸序列具有近80%的同源性所致，为消除干扰信号的产生可采用CSCWI基因与CUCWI同源性较低的上游或下游区制作探针进行杂交。此外也可通过提高杂交温度和洗膜的严紧度来降低非特异性的杂交信号(Sambrook et al., 1989;李德葆等, 1996)，以达到真实反映其中一个探针杂交结果的目的。由于4个成员间相对较低的核苷酸和氨基酸同源性使得它们不会在Northern和Western杂交中干扰主信号的获得。4个成员的获得有利于研究各成员在不同组织和发育阶段的表达情况，为探讨它们各自在柑桔果实发育期间蔗糖的积累和分解中所起的作用，进而为理解果实发育以及含糖量这一品质性状形成机制打下基础。

植物液泡和细胞壁中存在的酸性转化酶又各有几种同工酶，柑桔中其它几种酸性转化酶的编码基因仍有待克隆。我们现已构建了柑桔基因组DNA文库，并从文库中分离出CSVI1和CSCWI全长基因，其中包括启动子在内的CSVI1全序列测定已完成，CSCWI全长基因的测序和其它几个全长基因的分离工作正在进行。