近10年来，随着环境扫描电镜、激光共聚焦显微镜、拉曼激光光谱仪等高精尖实验仪器引入木材科学研究领域，管胞细胞壁力学的研究得到了广泛关注。这类研究主要以针叶材管胞为研究对象，系统研究管胞的力学特性、影响因素、断裂机理，以期从细胞水平，甚至分子水平阐明决定木材宏观力学性能的主要因子，为林木育种和木材的基因改良提供必要的目标和指标。目前对木材纤维，特别是对针叶材管胞力学性能的研究已经成为细胞壁力学研究的主要内容。

针叶材管胞一般长1~5 mm, 宽仅为几十个微米，对其力学特性的研究往往要求高载荷和位移分辨率的测量仪器。通常采用的方法是对离析后的单根纤维(管胞)进行微拉伸，进行这类实验是非常困难和费时的，有许多环节仍有待于近一步改进。鉴于传统方法在测定木材纤维力学性质时有许多不足之处，并且离析纤维不可避免带来化学成分的变化，因此很有必要研究新的细胞壁力学性质测定方法。Wimmer等人(1997)首次提出使用纳米压痕技术测量针叶材管胞细胞壁的纵向弹性模量和硬度，为研究细胞壁的力学特性开辟了新的途径。本文在前人研究的基础上，首次运用纳米硬度测量技术中最新发展起来的连续刚度测量法(continuous stiffness method, 缩写成CSM)，对测定人工林杉木管胞细胞壁的纵向弹性模量和硬度的实验技术进行了有益探索。

1 材料与方法 1.1 材料

人工林杉木(Cunninghamia lanceolata)，树高20.5 m，胸径26.2 cm，树龄36 a，采自江西大岗山试验林场。

1.2 方法 1.2.1 纳米压痕技术测试原理

纳米压痕技术主要是通过连续测量加卸载过程作用在压针上的载荷和样品的压痕深度，并通过一定的理论计算，从而获得样品的玻氏硬度和模量(张泰华等，2002a；2002b)。

玻氏硬度(也称纳米硬度)定义为:

(1)

弹性模量可由下式算出：

(2)

式中：P为最大压痕深度时压针上的载荷；A为最大压痕深度时压痕的投影面积，可根据经验公式算出；E_r为复合响应模量，可根据载荷-压痕曲线和弹性接触理论计算出；E_i、v_i分别为压针的弹性模量和泊松比，在本次实验中，E_i＝114 1 GPa, v_i=0.07。要计算出E(被测样品的弹性模量)，必须先知道样品在该方向的泊松比v。应该指出，弹性模量对v的值不敏感，对于大多数材料，v在0.25±0.1之间时，E仅会产生5%的误差。根据Gibson等(1988)对许多学者实验结果的总结，针叶材管胞细胞壁的纵向泊松比(v_LR、v_LT)在0.37~0.47之间，因此取0.40作为本次研究细胞壁的纵向泊松比，对于Spurr树脂这类高分子材料，v=0.30。

上述方法只能得到最大压痕处对应的硬度和弹性模量。为此，Pethica等(1989)提出了在加载过程中连续计算接触刚度的测量原理，称为连续刚度测量法或固定频率的动态压痕测量法。原理是将较高频率(本次实验的频率为45 Hz)的简谐力叠加在准静态的加载信号上，测量压头的简谐响应，简谐力控制着位移的波动(一般1~2 nm)，从而实现接触刚度的连续测量。CSM技术能够研究硬度和弹性模量随压痕深度变化的规律，从而使纳米压痕技术的应用范围扩展到了高分子和生物材料等研究领域。

1.2.2 试样制作

使用纳米压痕仪测试管胞细胞壁的弹性模量、硬度时，试样制作和安装是最为关键的。在树高中部取一厚度为25 mm圆盘，在圆盘北向沿径向取一宽为10 mm的木条。在轮界处用锋利刀片取横截面为1 mm×1 mm，长为5 mm的小木条(图 1a)。之后的过程与透射电镜试样的制作方式相似：小木条经过不同浓度的酒精脱水至绝干，再用Spurr树脂浸注包埋，放在烘箱内以逐步升温方式固化(朱丽霞, 1983)。由于纳米压痕仪对试样表面的光洁度有极高的要求，所以包埋块的表面(横切面)需要用超薄切片机(LKB-2188)抛光，进刀厚度为1 μm。抛光后的试样需要通过二次包埋固定在一个圆柱形金属块上。根据仪器样品台的要求，圆柱体的直径为31.66 mm，并在圆心处开一个圆槽。把抛光后的长条形包埋块垂直竖立在槽内，注入二组分环氧树脂，在常温下固化(图 1b)，固化时间为半个小时到几个小时，最后把圆柱体固定到纳米压痕仪的样品台上进行测试。由于纳米压痕仪对样品的表面质量非常敏感，在二次包埋过程中，要注意避免对包埋块表面的任何损坏，包埋后最好用一个干净玻璃杯罩住圆柱体，减少样品表面可能粘上的灰尘。

木材的含水率对其物理力学性质有很大影响。本次研究的样品虽然在制作过程中经过酒精脱水至绝干，但在测试前长时间放置在温度21℃，相对湿度为60%的环境内；最重要的是，压痕实验的深度只有200 nm，因此在这段区域内样品的含水率达到了与周围环境的平衡，为10.9%。此外，由于细胞壁致密的结构，树脂只会填充到细胞腔内起支撑作用，便于随后的表面抛光，不会改变细胞壁的结构(Spurr, 1969)。

1.2.3 测试

所用的仪器为美国MTS公司的Nano Indenter XP，使用的是Berkovich压头。图 2为纳米压痕仪的测试原理示意图。

正式实验前进行了几次预备实验并对结果进行了仔细分析，确定了测试的实验条件：最大压痕深度h_max=200 nm，应变率0.05 s^-1。把样品装上水平定位平台后，利用仪器附属的光学显微镜观察样品表面(×1 600)。由于细胞壁的S₂层占整个细胞壁厚度的70%以上，并且具有较小的纤丝角，对细胞壁的纵向弹性模量起支配性作用，因此压痕大致位于S₂层的中部，每次实验的压痕数为5~10个。作为对比，实验中对细胞周围的连续树脂区域(图 4)也进行了20次压痕实验，得到了Spurr数值的硬度和弹性模量。在整个实验过程中，温度保持在21℃，相对湿度为60%，整个测试过程由计算机控制完成。

2 结果与分析 2.1 Spurr树脂的硬度和弹性模量

图 3给出了Spurr树脂5次典型压痕实验的载荷、硬度、模量与压痕深度关系曲线。固化良好的Spurr树脂为均质的各向同性体，压痕深度对其硬度和模量的影响应不显著, 但图 3表明，硬度和模量在压痕深度0~100 mm之间变化较大，这一段为仪器的不可靠工作区；大于100 nm后则迅速趋向平缓，仪器进入可靠工作区，压痕深度对Spurr树脂的硬度和弹性模量的影响不显著。不可靠工作区的大小与样品表面的粗糙度和压针的尖锐程度有关。之后，又陆续对不同样品的连续树脂区域进行了15次压痕实验，每次得到的硬度和模量均是可靠工作区内的平均值。表 1给出了Spurr树脂硬度和模量的统计值。

2.2 有效压痕的确定

如图 4所示，可以把样品表面划分为细胞壁、胞腔内不连续树脂和细胞周围连续树脂3个区域。实验的目标是对细胞壁进行压痕实验，从而获得细胞壁的纵向硬度和弹性模量。尽管纳米压痕仪在载荷和压痕深度测量上具有极高的精确度，例如压痕深度分辨率达到0.1 nm, 但仪器附属的X-Y定位平台的精度只有0.3 μm·inch^-1, 即压头在水平方向每移动2.54 cm, 就会产生0.3 μm的误差，并且每次实验进行的压痕次数越多，误差就会越大。由于杉木管胞细胞壁厚度只有3~7 μm，因此并不是每个压痕都可以精确无误地打在细胞壁上，有的压痕会落在细胞腔的树脂上，因此需要判断哪些压痕落在了管胞的细胞壁上。实验中得到了2种典型的载荷-压痕曲线(图 5)。A型曲线与大多数材料的正常载荷-压痕曲线相似，而B型曲线的卸载部分则与正常曲线的卸载部分完全不同，不仅载荷变为负值，压痕深度也呈现出负值，在对早晚材管胞胞壁的压痕实验中，都同时存在这两种曲线。研究认为，呈现B型曲线的压痕落到了细胞腔的树脂上(或胞腔和胞壁的交界处)，这是基于以下几个理由: (1)与样品四周的连续树脂区域不同，沉积在胞腔内的树脂被胞壁分割，呈离散分布，并与细胞腔内表面松散接触。因此在卸载阶段末期，压针与树脂之间的吸附力易于把树脂带出，从而出现负压痕和负载荷的异常现象，而在对连续树脂区域进行压痕实验时，由于树脂形成一个连续的整体，一般不会出现压针把树脂带起的现象，因此表现出正常的载荷-压痕曲线。(2)B型曲线得到的硬度和模量远小于A型，但与Spurr树脂的硬度和模量大小相当。(3)晚材区域的胞壁率比早材区域大得多，因此在对早材区域进行实验时，压痕落在胞腔树脂上的几率要大于晚材，这正好解释了在对早材管胞进行压痕实验时，出现B型曲线的概率为65.5%，远大于对晚材管胞进行压痕实验的32.1%的原因。基于以上理由，本研究认为根据Mode A曲线得到的是管胞细胞壁的硬度和模量。

2.3 次生壁S₂层的纵向弹性模量和硬度

图 6给出了次生壁S₂层载荷、硬度、弹性模量与压痕深度之间关系。在0~50 nm的范围内，纵向硬度和弹性模量随压痕深度增加而急剧增大，这段区域是仪器的非可靠工作区。样品的表面质量越好，非可靠工作区的范围就越小，就本次研究样品的表面质量而言，当压痕深度大于50 nm以后，样品表面质量对实验结果的影响可以忽略。从图 6可以清楚看出，压痕深度在大于50 nm后对细胞壁的硬度和弹性模量没有显著影响，因此在对管胞进行的每个压痕实验中，弹性模量和硬度均是深度在100~200 nm之间的平均值。

从表 2可知，杉木晚材管胞S₂层的平均纵向硬度为0.390 GPa，弹性模量的平均值为14.844 GPa；早材管胞S₂层的硬度和模量则明显小于晚材，平均值分别为0.306 GPa和9.823 GPa，可以从几个方面对此进行解释：(1)晚材纤维素的结晶度高于早材(Lee, 1961)，因此其力学性能优于早材细胞壁的纤维素；(2)晚材管胞S₂层的微纤丝角小于早材；(3)晚材的纤维素含量高于早材(Hale et al., 1963)。因此同一年轮内早晚材之间物理化学性质的差异是晚材管胞S₂层的纵向硬度和模量均高于早材的根本原因。其中S₂层微纤丝角之间的差异则是诸多因素中最具有决定性的：微纤丝角越小，纤维的纵向强度和刚度越好。这一点已经被许多实验(Page et al., 1977；1983)和理论研究(Salmen et al., 1985; Koponen et al., 1991)所证实。

Wimmer等(1997)使用类似技术得到的80 a生红云杉(Picea rubens)早晚材管胞S₂层的纵向弹性模量平均值分别为13.49和21.00 GPa。而本文根据Mode A曲线得到的结果为：早材管胞9.823 GPa(最大值为14.674 GPa)，晚材管胞14.844 GPa(最大值28.087 GPa)，所测的值虽然相对较小，但应该看到，由于这里的实验对象是30 a生的人工林杉木，力学性质性相对较差是合理的。然而，Cave(1968；1969)通过实验和理论计算上得到的云杉属管胞细胞壁纵向弹性在28~35 GPa之间，明显大于本次研究得到的实验值。最新的研究¹⁾也指出，如果仪器的压痕定位精度不理想，使用纳米压痕技术测得的弹性模量会小于实际值，原因主要有三：(1)纳米压痕仪在定位精度上不够理想，有些压痕不是落在S₂层中部区域，而是落在靠近细胞腔的边缘区域，这时细胞壁物质由于受到的束缚小，容易向细胞腔方向扩张，因此数值偏小；(2)试样表面质量不够理想；(3)压针在压入细胞壁时，细胞壁向下凹陷(sink in)，使实际接触面积的投影小于弹性接触模型的预测结果，这样测得的硬度和模量便会小于真实值。可见在纳米压痕技术能够更成功地用于细胞壁力学的研究以前，还有一些工作要做。就定位精度来说，随着科学技术的进步，这个问题已经得到了解决。据了解，MTS公司目前已经为Mano Indenter XP开发出新的纳米级定位平台，分辨率达到了2 nm，并且通过把力学测试和压痕原位成像统一到同一根压针上，实现了压痕的原位成像，这对研究木材这类生物胞状材料以及证实压针压入时细胞壁上是否出现了凹陷现象非常有利。因此今后所要重点解决的问题是如何提高样品的表面质量，这是因为表面质量越好，不仅测试精度越高，还可以直接在细胞壁的S₁、S₃层，甚至胞间层上进行深度更小的压痕实验，从而获得细胞壁厚度方向的力学性质变异规律，把细胞壁力学的研究提高到一个更高的水平。

1) 余  雁.人工林杉木管胞的纵向力学性质及其主要影响因子研究.中国林业科学研究院博士论文，2003

3 结论

本文探索了利用纳米压痕技术测量人工林杉木管胞次生壁S₂层纵向弹性模量和硬度的实验技术。首次运用连续刚度测量法测定了人工林杉木管胞细胞壁的纵向弹性模量和硬度。实验结果表明，在同一年轮内，晚材管胞细胞壁的纵向硬度和模量均高于早材。晚材管胞S₂层的纵向弹性模量在7.175~28.087GPa之间，早材管胞则在7.160~14.674 GPa之间。

通过与前人研究的对比，发现目前使用的纳米压痕仪得到的管胞纵向弹性模量和硬度比实际值偏小，这除了仪器的定位精度和样品的表面质量不够理想外，压针压入时细胞壁上产生凹陷现象可能也是原因之一。本次研究所使用的纳米压痕仪在载荷和位移方面具有足够的分辨率，但其压痕的定位精度对于研究木材这类生物材料还不十分令人满意。对于木材这类生物胞状材料，最好使用具有纳米级压痕定位精度和原位成像功能的纳米压痕仪，同时应重点研究使细胞壁表面的粗糙度达到纳米级(小于10 nm)的制样技术。这样就可以直接在管胞弦径壁、细胞角隅处、甚至细胞壁的各层直接进行小压痕深度的力学测试，使细胞壁力学的研究达到更高的水平。