林木种子园是林木良种繁育的主要形式，是育种系统的重要组成部分。我国自20世纪60年代建立第1批种子园以来，在种子园建设及相关科研方面取得了显著成绩。到了80年代，林木良种研究列入了国家重点科技计划，近27个主要造林树种相继营建了种子园共1.3×10⁴ hm²，累计生产种子100×10⁴ kg。油松(Pinus tabulaeformis)作为我国北方的主要造林树种，全国已建成部、省合建油松良种基地17处，分布于7个种子区，种子园面积达470 hm²，目前已投入一半以上，年产种子7 000 kg(张华新，2000)。但目前油松种子园产量普遍低而不稳，质量也很难满足我国造林绿化良种的要求。针对影响种子产量和质量的一些因素，如种子园无性系间的交配方式、交配成功率等交配动态进行了研究，以更好的指导种子园的管理。

1 材料与方法 1.1 实验地和材料来源

辽宁兴城油松种子园始建于1974年，面积20 hm²，位于北纬40°43'~40°44'，东经120°34'~120°35'；阴坡，坡度5~15°。建园无性系数49个，分别来自辽宁抚顺林区、辽宁兴城和内蒙古宁城黑里河林场的10多个天然和人工群体优树，无性系按7×7顺序排列，各重复配置设计一致圃地嫁接后定植，株行距5m×5m。于1993年春进行了1/3强度疏伐，淘汰树高显著低于对照20%左右的无性系。距种子园下风向3 000 m处有1处面积为50 hm²的天然林。

种子试样分别于1984、1987、1993、1996和2000年采集，每株取5~8个球果，从每个无性系球果的混合种子中取8~10粒用于胚和胚乳的同工酶分析。其中1984年采集17个无性系的25个单株，同工酶分析200粒种子。1987年对5个无性系单株分树冠的上、中、下3层各采50~70粒种子，用于同工酶分析700多粒。1993年种子试样采自34个无性系，同工酶分析300粒。1996年的种子试样采自24个无性系，同工酶分析200粒；2000年采集15个无性系，同工酶分析120粒种子。其中1984和1987年种子于冰箱-20℃储藏。

1.2 同工酶分析和酶系统

同工酶采用水平淀粉凝胶电泳方法，共分析了8种酶：其中ACP(acid phosphatase酸性磷酸酯酶E.C.3.1.3.2)、LAP(leucine-amino-peptidase亮氨酸氨肽酶E.C.3.4.11.1)、GOT(aspartate aminotransferase天冬氨酸转氨酶E.C.2.6.1.1)、PGM(phosphoglucomutase磷酸葡萄糖变位酶E.C.5.4.2.2)、MDH(malate dehydrogenase苹果酸脱氢酶E.C.1.1.1.37)和ADH(alcoholdehydrogenase乙醇脱氢酶E.C.1.1.1.1)的各1个位点，SKD(shikimate dehydrogenase莽草酸脱氢酶E.C.1.1.1.25)和MNR(menadione reductse维生素K3还原酶E.C.1.6.99.2)各2个位点。样品提取液、电泳和凝胶缓冲液、酶谱和解释参见有关文献(Shen, 1981; Wang et al., 1991; 张春晓等，1999)。

1.3 交配系统指标估算

以同工酶位点谱带作为遗传标记，运用Ritland的混合交配系统模型MLT程序估计无性系的单位点和多位点异交率，自交率及其标准差。MLT估算原理参见(张冬梅等，2000)。

1.4 花粉污染率估算原理

种子园花粉污染的遗传分析采用Adams和Burczyk编写的GENFLOW程序。该程序是一多位点估算程序，利用电泳数据估算针叶树种的无性系种子园花粉污染水平。通过比较每个花粉配子和种子园中所有无性系的多位点基因型，把那些和种子园中无性系产生的多位点基因型不同的花粉配子称做观测污染者，然后除以总的取样花粉配子数(n)就得出花粉观测污染率(b)。由于这种方法存在无法检测与园内花粉具有相同基因型的部分外源花粉的弊端，估算的污染率常被称为最低污染水平(Nagasaka et al., 1985; Wang et al., 1991; Paule et al., 1993)。目前，GENFLOW可以利用d对观测污染率进行调整。d是具有和种子园中在任何位点产生的多位点基因型不同的背景花粉配子比例，是对检测可能性的一个估算。种子花粉污染率(m)可用b除以d得到。这个估算假定所有的多位点配子都存在于1个至少由100个无性系组成的背景源中，而种子园的无性系只能产生有限的多位点子。所以，这个程序在背景源和种子园的单位点等位基因频率已知时可以应用。

2 结果与分析 2.1 种子园交配系统的时空变化 2.1.1 种子园不同年份的交配状况

利用MLT程序分析了种子园结实初期(1984)、结实盛期疏伐前(1993)、结实盛期疏伐后(1996)和结实后期(2000)4个年份种子园子代群体的交配状况(表 1)。结果表明：自然状态下，1984和1993年种子园子代的多位点异交率(t_m)没有太大差别，分别为0.975和0.962，自交系数差异很小，分别为0.025和0.038。同样，去劣疏伐后的1996和2000年种子园子代的t_m差别也不大，分别为0.795和0.801，自交率分别为0.205和0.119。但种子园于1993年进行了去劣疏伐，疏伐前后2个年份的交配指标差异明显，异交率由1993年的0.975降到1996年的0.795；自交系数也由1993年0.038增至1996年的0.205。

为了进一步了解种子园不同年份的交配动态，对不同异交率范围的无性系在种子园不同时期的分布作了统计(见图 1)。从图 1可看出，种子园1984年的17个无性系中，异交率在0.4~0.6范围的占11.8%，大于0.8的无性系占82.4%。而1993年种子园的34个无性系中没有出现异交率小于0.6的，大于0.8的无性系占了88.2%。从这一结果看，尽管种子园在1984和1993年的异交率都很高，但种子园在1984年内具有较高自交率单株的比例要比在1993年的多，也就是说由于种子园无性系单株的花粉产量悬殊较大，结实初期单株的实际自交程度要比结实盛期的高(张冬梅等，2001)。而从疏伐后(1996和2000年)种子园内无性系的异交率分布看，有相当数量的无性系单株的异交率在0.2~0.4范围内，在1996年和2000年中分别占8.3%和6.7%。异交率在0.4~0.6范围内的无性系数量也比疏伐前有大幅增加，分别占无性系总数的20.8%和13.3%，但异交率大于0.8的无性系要比疏伐前减少，占54.2%和40%，从这一点可以看出由于疏伐减少了单株数，从而花粉总量也有降低，造成疏伐后一段时间内种子园内单株的自交程度明显增高。

2.1.2 种子园交配系统在不同冠层的变化

试验对种子园1987年的种子试样进行同工酶分析。在7种酶的10个位点上利用MLT程序估算树冠不同层次种子的交配指标，结果见表 2。从整体水平看，不同冠层种子的异交率差异不大。上层多位点异交率最高，达到0.910，下层多位点异交率较低(0.900)。而上层自交种子比例(0.090)低于下层(0.100)。

为了进一步了解树冠不同层次采种无性系的遗传组成，根据混合交配模型对树冠不同层次采种无性系的异交率作了估算(见表 3)，同一层次不同无性系的交配情况有差异。上层4个无性系的异交率变幅在0.83~1.16间，异交率普遍较高。中层中5个无性系的异交率变幅是0.70~2.00，其中19#无性系的自交严重，自交率为0.30，其余4个无性系的异交率都很高。但下层的异交率差异很大，31#无性系的自交程度较严重，异交率仅为0.55，同时19#无性系的自交水平偏高，异交率为0.63。另外，同一无性系在冠层的不同部位的种子试样交配情况也有差异。4#、19#、43#无性系在不同层次表现一致，19#无性系在各层的自交率普遍较高，而4#无性系在各层中的异交率都很高。31#无性系出入很大，在下层的异交率仅有0.55，在上层却高达0.96。这一结果充分显示了各无性系的遗传结构既有普遍性，又有特殊性。19#无性系的自交现象要高于其他无性系。从分层分析的结果看，同一无性系单株在接受花粉上具有一定的选择性，下层更易接受自身花粉。

2.2 种子园花粉污染率的时空变化 2.2.1 种子园亲本和子代基因频率

根据MLT对1984、1993、1996和2000年4个年份的种子试样同工酶数据的分析，得出种子园4个年度各亲本无性系和它们的子代在8个位点上的等位基因频率(表 4)。种子园4个年份的子代在got2的a等位基因、lap1的a等位基因以及lap2的a等位基因上都出现了亲本无性系所没有的等位基因。另外，1993和1996年的种子在pgm1位点的e等位基因上出现了外源花粉的基因，从这一点可以看出种子园存在明显的外源花粉污染。

2.2.2 种子园不同时期的花粉污染状况

利用GENFLOW分别对4个年份的花粉迁入情况进行了估算，结果见表 5。种子园第1种植区在1984、1993、1996和2000年的观测污染率分别为0.326, 0.450, 0.532和0.385，估测污染率分别为0.354、0.492、0.583和0.418，平均污染水平达到0.462。从这一结果看，1996年的花粉污染率比1993年大幅上升。考虑本次研究的结果与种子园在1993年秋经过1/3强度疏伐有关。类似结果见Caron和Leblanc(1992)对北美云杉实生苗种子园连续3a(1987、1988、1989)的花粉污染率作的估算，他分析1988年花粉污染率急剧上升的原因之一是由于疏伐掉园内40%的树木。

为了进一步了解采种无性系在种子园中的相对位置对污染率的影响，分别估算了1984年种子园第1种植区上风方向和下风方向的种子污染率分别是0.361和0.356，上风方向稍大于下风方向，但二者差异不大(见表 6)。Harju和Muona(1989)对污染水平与分株在种子园中所处位置、授粉期主风向没有必然联系所作的解释是，可能是由于研究的种子园区面积太小，以致于外源花粉进入种子园后基本上能飞达种子园内任何区域。同样方法，对种子园不同树冠层花粉污染率作了估算，下层污染率(0.273)要高于中层(0.138)和上层(0.121)。

3 结论与讨论 3.1 种子园近交及自交的效应

通过对兴城油松种子园4a种子试样的交配系统分析，尽管每年都存在一定程度的近交及自交，但疏伐前(1984和1993年)种子园的自交并不严重，而强度疏伐后的两个年份(1996和2000年)自交率急剧增加，分别达到0.205和0.119，比疏伐前的平均水平提高了270%~540%。为了解种子园种子的近交(自交)衰退状况，对种子园于1984年树冠不同部位采集的饱满种子和空籽数进行统计，并将每个球果的饱籽数、空籽数与单株异交率进行回归分析，树冠上层每果饱籽数、空籽数与异交率的相关系数分别为0.76^*和-0.72^*。而树冠下层分别为0.69^*和0.68^*。同时，对回归方差和离回归方差进行F测验的结果表明，树冠上、下层每果饱籽数与异交率都呈显著的正相关，每果空籽数与异交率呈显著的负相关(见图 2a ~d)。这表明，异交率高的无性系单株获得饱满种子数多，空籽数相对较少。类似的研究结果国外曾有报道(Jo，1985；Woods et al., 1989; El-Kassaby et al., 1990)。

有研究证明近交和自交衰退可以发生在生活周期的不同阶段，生活史后期受的影响可能更大(Charlesworth et al., 1987)。一些学者发现，对于风媒授粉树种，种子园中较高的自交多导致子代群体经济性状的较大分化和平均水平的下降(Wright, 1969; 沈熙环，1988；Moran et al., 1989; Brown, 1990)，并且影响种子的生产效率(王晓茹等，1989)并产生大量空籽(张华新，2000)。Matheson(1995)等人对湿地松近交效应的研究，发现在高生长、抗锈病及分枝等性状上表现出的近交衰退与近交系数呈直线相关。Sorensen(1997)同样证实了花旗松半同胞间、亲子间和全同胞间的近交可使子代高生长下降2.3%。所以，如何在生产实践中减少近交及自交是种子园研究的重要课题。

基于兴城油松种子园的实际情况，在结实初期(1983年)，建园的49个无性系已全部着生雌球花，着生雄球花的无性系达40个，但其中9个无性系的雄花量占总花量的80%(沈熙环等，1985)，无性系偏雄现象较严重。到了结实盛期，虽然全部无性系都已着生雌雄球花，但无性系间仍存在雌雄花量的不均衡现象(李悦，1994)。这些因素都可能导致种子园中非随机交配的发生，造成近交(自交)的遗传结果。另外，通过对兴城种子园的研究，王晓茹等(1989)曾提出过种子园存在选择性受精的现象。李悦等(1994)发现，有的父本甚至不能与某个或某些母本组配。张冬梅等(2001)对种子园3个年份自由授粉种子的父本分析也发现，种子园中并非所有的无性系个体都可配，显然，种子园中选择性受精现象的存在，也可能造成近交(自交)的产生。目前，对种子园中存在的非随机交配现象和配子的选择性受精机制的研究还需进一步深入。但在生产实践中发现，采取辅助授粉可以降低近(自)交率。除了控制相同无性系分株间距外，花枝修剪、辅助授粉、无性系选型配置和建设控制授粉种子园等措施的综合应用，可能会取得满意的结果。

3.2 种子园花粉污染率的时空变化

种子园内花粉的产量对种子园花粉污染的水平有一定的影响。El-Kassaby等人(1986)对一花旗松种子园的污染率进行了研究，在散粉期内，散粉盛期的污染率比散粉初期和末期的低。还有研究发现华盛顿的一个花旗松种子园中的花粉污染水平随花粉产量增加而直线下降(Wheeler et al., 1986)。然而，大部分的研究未能证实园内花粉产量和花粉污染水平之间的关系。一些研究表明，尽管种子园内花粉产量相当高，花粉污染水平仍很高(El-Kassaby et al., 1989；Adams, 1991; Di-Giovanni et al., 1991; Wheeler et al., 1992)。他们认为，外源花粉量对种子园花粉污染的影响或许比以前估测的大，因此建议加强对周围林分花粉量的研究。

从对辽宁兴城种子园第1种植区的4个年份种批的花粉污染率估算结果看，种子园受污染较严重。原因之一，1984和1993年分析的种子试样都是储存的种子批中，自交产生的种子大多未能正常发育成熟或不能发芽，而不能用于同工酶分析。而外源花粉每次成功的授粉都属于异交，由于分析的种子试样中外源花粉授粉产生的子代比例相对较高，使估测的污染率升高。另外，种子园1993年的花粉污染水平高于1984年，似乎不容易被人们接受，种子园在1993年的花粉种类和产量要比1984年的高，园内充足的花粉量必定稀释外源花粉，花粉污染率理应有所降低。这是因为花粉污染率的随机性很强，从以往这方面的研究看，并没有固定模式可循。

其它因素对种子园花粉污染影响的研究也有报道。诸如花粉污染率在不同年份间(Harju et al., 1989)、污染水平与分株在种子园中所处的位置、授粉期主风方向(Yazdani et al., 1991；赖焕林，1993)等对污染率的影响。本文通过兴城种子园1984年采种试样的迎风角种子和下风方向种子污染率对比来看，污染率没有明显差异。而对种子园树冠不同冠层花粉污染率作的估算表明，下层污染率要高于中层和上层，而从理论上来讲，树冠上层接受花粉的种类最多，而下层接受树体自身花粉的机会更大，所以，上层受污染的程度理应大于下层。但是，考虑油松花粉既小又具气囊，不排除在气流的抬升下，上层雌球花接受自身花粉的可能性也很大。张华新(2000)通过对河南卢氏油松种子园31个无性系的开花物候树冠不同部位差异的研究发现，树冠中、下部位球花可授期和散粉期的差异并不明显。所以，造成树冠不同部位花粉污染率估算值有所差异的随机因素很多，主要与受试无性系单株的树体结构、采种方位、授粉期的主风方向等有关。由于对树冠不同部位种子花粉污染的估算缺乏年度间对比，花粉污染率在树冠不同部位的表现还有待于进一步研究。

借助同工酶手段估算的污染率，由于外源花粉中有一部分与园内花粉具有相同的基因型，不易被检测出来，种子园实际存在的污染水平比估算值还高。所以，衡量一种子园的花粉实际污染水平要结合种子园本身的特性，采取相应的管理措施。针对花粉污染对种子园的遗传增益造成的影响，已有的报道意见不统一，所以，辽宁兴城油松种子园较高花粉污染水平给种子园的遗传效应带来的影响须进一步研究，建议花期进行人工控制授粉是目前最有效的措施。另外，分析引起油松种子园花粉污染的原因，下风向的天然林对它的影响可能不大，而距种子园上风向500 m处的一片油松种子园子代测定林可能对它产生影响，可以考虑伐去。