木麻黄(Casuarina)是我国南方沿海防护林的重要树种, 在防风固沙、保护农田、提供薪炭材、改善生态环境和发展沿海地区经济等方面发挥着巨大的作用。木麻黄同时也是一类放线菌结瘤植物, 在自然状态下能与放线菌Frankia共生, 形成根瘤, 固定空气中的氮素, 使树木能够在养分贫瘠的沙地上生长良好。因此开展木麻黄共生固氮研究, 对于提高木麻黄的共生固氮效率, 促进防护林生长更新有着重要的理论意义和应用前景。

自Diem等(1982)从木麻黄根瘤上成功分离到Frankia纯培养菌株DI₁和G₂以来, 各国学者在木麻黄Frankia的分离培养(Zhang et al., 1984; 蒋建德等, 1985; 李志真等, 1998)、形态特征(李忠伟等, 1986; 黄雅丽等, 1989)、生理特性(袁长芳, 1987a; 1987b; 康丽华等, 1996; Torrey et al., 1984; Zhang et al., 1985; Lechevalier, 1994)、同功酶(张道海等, 1989)、限制性酶切图谱(Nazaret et al., 1989)、宿主侵染(Baker, 1987; Torrey, 1989)、分子多态性(Rouvier et al., 1996)等诸方面进行了研究。关于Frankia分类, 现今只确定至“属”, 尚不能进行“种”的划分(胡传炯等, 1997; Lechevalier, 1994)。木麻黄分布广泛, 生态环境多种多样, 目前分离培养和研究的Frankia菌株来源及数量有限, 菌株间表现出丰富的差异性, 因此有必要更广泛地收集Frankia菌株, 开展其生物学特性和共生特性研究, 为深入了解Frankia菌, 正确进行分类提供基础。基于此, 本文针对福建、广东沿海和山地生长的木麻黄根瘤内生菌开展了形态培养、生理类型、营养源利用、代谢酶、宿主特异性等生物学特性的系统研究。

1 材料与方法 1.1 试验材料

参试木麻黄根瘤内生菌17株, 16株分离自福建沿海和山地的细枝木麻黄(Casuarina cunninghamiana)、短枝木麻黄(C. equisetifolia)和粗枝木麻黄(C. glauca)等根瘤, 1株来自广州的短枝木麻黄, 由中国林业科学研究院热带林业研究所康丽华研究员惠赠。以杨梅(Myrica rubra)Frankia菌株2215、FMr59和四川桤木(Alnus cremastogyne)Frankia菌株FAc01为对照, 2215分离自云南杨梅根瘤, 为中国科学院微生物研究所刘志恒研究员赠送, FMr59、FAc01分别从福建杨梅、四川桤木根瘤上分离获得。各菌株的宿主来源见表 1。

1.2 研究内容和方法 1.2.1 形态特征

17株木麻黄根瘤内生菌和3株对照菌株分别接种于S(Lechevalier et al., 1983)、BAP (Murry et al., 1984)、JA(Akkermans et al., 1983)等3种液体培养基内, 27 ℃静置培养4~12周, 于光学显微镜和电子显微镜下观察各菌株的形态结构。

1.2.2 培养特征

20株根瘤内生菌接种于S、BAP、JA等液体培养基内, 27 ℃静置培养4~8周, 观察菌株在液体培养基中的生长特征。同时观察生长于S斜面培养基上的固体菌落特征。

1.2.3 生理类型

根据Lechevalier等(1983)的生理类群划分方法, 将经同期预培养的参试菌株接种于含Tween-80和不含Tween-80的10 g·L^-1葡萄糖的NAZS培养基(分别记作10S和10S+T), 27 ℃暗处静置培养, 6周后测定菌丝体的生长量, 以比较其生理类群。另外就不同类群各取1个菌株在含Tween-80和无Tween-80的10 g·L^-1和20 g·L^-1的葡萄糖培养液中培养2、4、6、8周, 根据菌株生长量进一步检测其生理类群:NAZS基础培养基, 简称S; S+10 g·L^-1葡萄糖, 简称10S;S+20 g·L^-1葡萄糖, 记为20S;S+2 g·L^-1Tween-80, 简称T+S; S+2 g·L^-1Tween-80+10 g·L^-1葡萄糖, 记为T+10S;T+S+2 g·L^-1Tween-80+20 g·L^-1葡萄糖, 简称T+20S。接种时先离心收集预培养菌丝体测定其生物量, 根据生物量匀浆稀释, 使单位体积含相同重量菌丝体, 等量接种于上述各培养基。

1.2.4 营养源利用

碳源  分别以10 g·L^-1的甘油、山梨醇、木糖、甘露糖、葡萄糖、果糖、乳糖、蔗糖、麦芽糖、吐温和1 g·L^-1可溶性淀粉代替BAP中的丙酸钠, 其它成分不变。以1.2.3方法稀释菌体等量接种, 27 ℃暗处静置培养4周, 观察菌丝体生长, 加入10 g·L^-1的溴甲酚紫数滴以检测菌株是否利用碳源产酸。以不含碳源的BAP培养基菌株生长为对照。有机酸分别以2 g·L^-1的乙酸钠、丙酮酸钠、丁二酸钠、苹果酸钠、草酸钠、苯甲酸钠等6种有机酸取代BAP中的丙酸钠, 以加入丙酸钠和不含碳源的BAP菌株生长为对照。氮源以10 g·L^-1的硫酸铵、硝酸钾、尿素、蛋白胨、牛肉膏、酪蛋白代替BAP中的氯化铵, 其它成分不变, 以不含氮源的BAP菌株生长为对照。每种处理均设3次重复。

1.2.5 其它生理特性

以无碳源的BAP为基础培养基进行下列生理试验。纤维素酶在基础培养基中加入滤纸条, 如果菌体生长, 说明菌体能分泌纤维素酶。蛋白酶在基础培养基中加入1 g·L^-1酪素, 如果菌体生长, 说明菌体产生蛋白酶。尿素在基础培养基中加入0.5 g·L^-1丙酸钠和1 g·L^-1尿素, 培养4周后用酚红作指示剂检测。如果培养液变红为阳性反应, 说明菌株能利用尿素。硫化氢在基础培养基中加入0.5 g·L^-1丙酸钠、10 g·L^-1胰蛋白胨和0.5 g·L^-1柠檬酸钠, 如果培养后有黑色产物出现, 说明菌体能产生硫化氢。硝酸还原在基础培养基中加入0.5 g·L^-1丙酸钠和1 g·L^-1KNO₃, 培养4周后, 加格里斯试剂测定硝酸盐还原反应。苯丙氨酸在基础培养基中加入0.5 g·L^-1丙酸钠和2 g·L^-1的苯丙氨酸, 菌体培养4周后, 加入FeCl₃观察培养液是否变绿色, 变色的表明菌体能利用苯丙氨酸产生苯丙酮酸。明胶液化在基础培养基中加入0.5 g·L^-1丙酸钠、200 g·L^-1明胶, 培养4周后观察明胶是否液化。每种处理均设3次重复。

1.2.6 固氮酶活性

将经同期预培养的20株参试菌株接种于无氮源的BAP中, 27 ℃暗处静置培养20 d, 收集菌体转移到9mL的玻璃小瓶内, 密封, 注入体积分数为10 %的乙炔, 振荡培养5 d, 用气相色谱仪测定乙烯生成量(丁鉴等, 1986), 同时以考马斯亮兰法测定各菌株菌体蛋白计算其固氮酶活性(Bradford, 1976)。

1.2.7 宿主特异性

20株参试内生菌经BAP或JA培养8~12周, 离心收集菌体, 匀浆制备成菌液接种剂。以菌液分别浸泡细枝木麻黄、短枝木麻黄、粗枝木麻黄、杨梅、四川桤木、沙枣(Elaeagnus angustifolia)等无菌幼苗2 h。苗木移栽至袋装的灭菌珍珠岩内。每菌株处理6~11株, 接种量为每株0.05~0.1 mg湿菌体, 每个菌株接菌苗放置在同一育苗框内, 各育苗框单独排放以避免交叉感染。以冷开水浇育苗木, 每2~3周浇以50~100 mL的无氮Sider-young苗木营养液(休伊特等, 1965), 接种4~6月后调查苗木结瘤状况。

2 结果与分析 2.1 形态特征

光学显微镜和电子显微镜下的观察结果表明, 20株参试菌株在4种液体培养基中都具有分枝菌丝、孢囊或泡囊等形态特征。

2.1.1 菌丝体

菌丝体呈分枝丝状, 粗细不均。木麻黄根瘤内生菌FCc64、FCc90、FCc91、FCc92、FCc93、FCe19、FCe23、FCe33、FCe37、FCe42、FCe72、FCg77菌丝体粗大, 直径约在0.53~1.00 μm, 波曲不多; 菌株FCc^AC02、FCc^AC04、FCg07、FCg08、9550菌丝体中等粗细, 直径约在0.33~0.50 μm, 较多分枝; 菌株FCe75菌丝体细, 高度分枝波曲, 直径约为0.20~0.40 μm。对照菌株2215、FAc01的菌丝体较粗大, 直径在0.33~0.67 μm, 而FMr59菌丝体比较细, 波曲高, 分枝多, 直径在0.35 μm以内。同一种菌株在不同培养液的菌丝体粗细大小略有变化。

2.1.2 孢囊

参试菌株形成孢囊的数量因培养基不同而异。培养4~6周时, 对照杨梅菌株FMr59、2215在3种培养液内均形成大量的孢囊, 且孢子已成熟, 开始发散; 桤木菌株FAc01仅在BAP中形成少量孢囊, 但是在S、JA培养基中孢囊数量较多; 木麻黄参试菌株在JA中可形成孢囊, 而在BAP中只有FCc64、FCc92、FCe33、FCe37、FCe42等形成孢囊。该结果说明在BAP培养液中木麻黄菌株的营养生长时间长, 在JA内菌株较快进入生殖生长, 形成孢囊, 这可能与JA中富含有机物、营养生长很快得到满足有关。孢囊形状多为球型、草莓型、纺锤型、豆荚型、长棒或短棒型, 有的在棒状孢囊中间凸起或凹入, 形成不规则孢囊(图 1、2)。成熟孢囊的宽度为1.30~31.30 μm, 长度为2.67~46.50 μm。孢子多呈圆型或卵型, 边缘先成熟, 成熟时大小约1.00~1.67 μm。

2.1.3 泡囊

多数木麻黄菌株在含氮源的液体培养基中不形成泡囊, 但FCc^AC04、FCc92、FCe37、FCg77等4株菌株在有氮的BAP和S培养基中能形成泡囊。杨梅菌株2215、FMr16在含氮的BAP、S、JA中都能形成泡囊, 桤木菌株FAc01在含氮的BAP中不形成泡囊, 在含氮的S、JA则产生泡囊。这些观察结果说明泡囊的形成受到养分和菌株个体的影响。木麻黄内生菌FCc^AC02、FCc^AC04是从同一环境生长的细枝木麻黄根瘤中分离得到的, 但是它们在3种培养基中形成泡囊的能力各不相同。所有参试菌株在无氮BAP中都可以形成泡囊。泡囊的形状为圆形(图 1), 大小约0.70~2.00 μm。菌株来源和培养基成分对泡囊的形状和大小无甚影响。

2.1.4 串珠状菌丝

在木麻黄内生菌FCc64、FCc92、FCe33的菌丝体中, 发现有部分菌丝形成串珠状菌丝段(图 3), 其长度不等, 类似于链霉菌上的分生孢子链; 在一些串珠状菌丝的一端或中间有膨大的椭圆形结构。目前已报道木麻黄、胡颓子(Elaeagnus pungens)、马桑(Coriaria nepalensis)等部分Frankia存在串珠状菌丝段(Diem, 1985; 胡传炯, 1997), Diem认为这种结构是Frankia的另一种繁殖方式。

2.2 培养特征 2.2.1 液体培养特征

参试内生菌菌丝体大多生长在试管的底部, 呈致密颗粒状、疏松絮状或絮状颗粒等, 部分菌株如木麻黄FCe42、FCe72、FCe75以及参考菌株2215附着在试管壁上生长, 紧密或松散。一些菌株能形成菌膜, 如菌株FCc^AC02、FCc^AC04在S培养基中形成菌膜, 但在BAP和JA中不形成菌膜。2个菌株在S、BAP中呈颗粒状, 在JA中则为絮状, 这说明了菌株的培养特征因养分不同而发生变化。木麻黄内生菌多呈浅白色或荔肉白, 与对照桤木内生菌FAc01色泽相似, 杨梅内生菌2215、FMr59则为浅红色。参试菌株在3种培养基中均不分泌可溶性色素。各菌株在不同培养基中的生长表现略有差异。等量接种及相同条件下培养, 菌株FCg07、FCe37在BAP中生长较差, 其它木麻黄菌株在3种培养基中均生长良好, 杨梅菌株在S和JA、桤木菌株在BAP和JA中生长良好。

2.2.2 固体培养特征

20个参试菌株在S固体斜面上均不产生气生菌丝, 不分泌可溶性色素。木麻黄菌落多为灰白色、灰黄色, 菌落凸起, 光滑致密, 有光泽; 但是FCe33、FCe72菌落质地松软。杨梅2215、桤木FAc01菌落凸起致密, 杨梅FMr59在固体斜面上则呈放射状, 坚韧无光泽。

2.3 生理类群

Lechevalier等(1983)根据Frankia对葡萄糖的利用状况划分生理类群。无Tween-80条件下菌株能良好利用葡萄糖, Tween-80存在使菌株生长受到抑制的为生理A群; 缺乏Tween-80菌株对葡萄糖利用不良, 加入Tween-80能明显促进菌株生长的为生理B群。从表 2结果可知, 加入Tween-80, FCc92、FCe42等2株菌株生长受到抑制, 属生理A群。FCc91、FCc93、FCe23、FCe33、FCe37、9550、FCg07和FCg08等8株菌株在加入Tween-80后能更好地利用葡萄糖, 生长得到促进, 为生理B群。另外5株菌株无论Tween-80存在与否, 菌丝体都能达到相同的最大生长量, 表明这些菌株同时包含A群或B群的特性, 为AB混合群, 它们是FCc^AC02、FCc^AC04、FCe19、FCg77。参考菌株杨梅FMr59、2215和桤木FAc01在加入Tween-80后生长更好, 属生理B群。随机取不同生理类群的3个菌株FCc92、FCc^AC02和FCe23进行2、4、6、8周的生长动态观察, 其结果验证了上述生理类群的划分(图 4)。

从上述试验结果可知, 木麻黄内生菌属生理B群的多。在同一种植物的根瘤内有不同生理类群的内生菌存在, 如细枝木麻黄内生菌FCc^AC02、FCc^AC04属AB群, FCc92为A群, FCc91和FCc93则为B群。来自同一地点的同一种木麻黄, 其根瘤内生菌也有不同的生理类群, 如同是来自惠安的短枝木麻黄内生菌, FCe33和FCe75为B群, FCe72则为AB群。

2.4 营养源利用 2.4.1 碳源

除了菌株FCe75外, 所有木麻黄和参照杨梅、桤木菌株都能在以吐温为碳源的培养基中良好生长。个别菌株能利用少数单糖、双糖或多糖, 如FCc^AC02、FCc^AC04能少量利用甘油, FCc92、FCe23、9550能良好利用葡萄糖, FCc92可稍微利用蔗糖, FCc^AC04、FCc64、FCc92和9550能少量利用淀粉, 参试木麻黄菌株均不能利用山梨醇、木糖、甘露糖、果糖、乳糖、麦芽糖。参考菌株杨梅FMr59和桤木FAc01能少量利用甘露糖并产酸, 2215能利用葡萄糖。所有菌株在无碳源的培养基中均不生长。

2.4.2 有机酸

20株参试菌株在以乙酸钠、丙酸钠、丙酮酸钠为碳源的培养基中生长良好。少数菌株能利用丁二酸钠、苹果酸钠、草酸钠、苯甲酸钠等有机酸, 如FCc^AC02、FCc92、FCg08和桤木菌株FAc01能良好利用丁二酸钠, FCc92可较好地利用苹果酸钠, FCe19和FCe42在草酸钠培养基中有一定生长。FCe19可少量利用苯甲酸钠, 其它参试菌株则均不利用。

2.4.3 氮源

各菌株利用各种氮源的能力有差异。除了FCc^AC02和FCg77外, 其它木麻黄内生菌和3株参考菌株均能很好地利用酪蛋白。能同时利用铵态氮、硝态氮和牛肉膏的菌株有11株, 它们是FCc64、FCc91、FCc92、FCe23、FCe33、FCe37、FCe75、9550和参考菌株2215、FMr59和FAc01。FCg08可利用氨态氮, FCc90和FCg07能利用硝态氮, FCc^AC02、FCc90、FCe42、FCg07、FCg08和FCg77等6个菌株还能利用牛肉膏。所有菌株不能利用尿素和蛋白胨, 但在缺乏氮源的培养基中都能良好生长。

2.5 其它生理特性

参试20个菌株均不能使明胶液化, 不能水解纤维素, 不能产生硫化氢, 不利用苯丙氨酸, 但都能水解尿素。部分菌株还能水解酪素, 这些菌株为FCc^AC02、FCe37、FCe42、FCg08、FCg77和参考菌株FMr59, 能还原硝酸盐的菌株有FCc92、FCe19、FCg77、9550和参考菌株2215、FMr59和FAc01。

木麻黄根瘤内生菌在营养源利用和相关生理特性上的差异反映出Frankia菌表型多样性的特点。

2.6 固氮酶活性

17株内生菌在离体培养下的乙炔还原活性见表 3。从表中可知, 菌株间固氮酶活性差异很大。FCe37的固氮酶活性最高, 达4.29 μmol(mg·h)^-1, 其次是9550、FCc64、FCg77、2215和FCe19, 其它菌株活性均较低。通过显微镜检查发现, 乙炔还原活性高的菌株, 泡囊形成的数量多, 活性低的菌株泡囊的数量也少。

2.7 宿主特异性

来自细枝木麻黄、短枝木麻黄和粗枝木麻黄的11株根瘤内生菌回接6种放线菌结瘤植物的试验结果见表 4。从表中看出, 11株木麻黄内生菌在木麻黄属内种间可以进行交叉侵染。少数木麻黄内生菌对杨梅、沙枣、四川桤木的侵染试验结果表明, 一些木麻黄内生菌能侵染杨梅、沙枣、桤木等结瘤, 而一些木麻黄内生菌则不能感染杨梅或沙枣, 如菌株FCg07不能侵染杨梅, FCg08不能感染沙枣结瘤。这些试验结果说明参试木麻黄Frankia菌株有一定的宿主特异性。

3 小结与讨论

参试木麻黄根瘤内生菌都具有分枝状菌丝、孢囊或泡囊等Frankia的特征性结构, 菌株FCc64、FCc92、FCe33等还具有串珠状菌丝段。根据国际上公认的弗兰克氏菌属的定义, 在形态特征方面描述为“内生菌纯培养呈放线菌样, 在液体培养中产生不动孢子的孢囊, 有可能形成泡囊”(Lechevalier et al., 1989), 所以, 本试验研究的17株木麻黄根瘤内生菌都是属于Frankia菌的成员。菌株在菌丝体大小、孢囊数量、泡囊形成等方面存在着明显的差异, 并随着培养基成分而变化。但是这些菌株在菌丝体形态、色素等培养特征上较为一致, 与桤木参照菌株相近, 但明显不同于杨梅参照菌株。

由Lechevalier等建立的生理类群划分是研究Frankia菌生理学特性的重要方法之一(Lechevalier et al., 1983; Benson et al., 1993)。本研究中木麻黄Frankia有A、B、AB等3种生理类群, 其中2个菌株为A群, 8个菌株为B群, 5个菌株为AB混合群。国际上从木麻黄根瘤分离获得的Frankia菌株多为生理A群(Benson et al., 1993), 本试验结果却相反, B群菌株多, A群菌株少, 这预示着我国南方沿海木麻黄共生Frankia类群可能不同于其它木麻黄Frankia。试验结果还表明在同一种植物的根瘤内有不同生理类群的内生菌共存。

绝大多数参试木麻黄Frankia菌株可以很好地利用吐温, 但只有少量菌株(FCc92、Fce32、9550)能较好利用葡萄糖, 3个菌株能少量利用甘油或蔗糖。这与国际上木麻黄菌株在含糖类物质的培养基生长良好相比有较大的差异(Benson et al., 1993), 但对有机酸的利用是相同的, 即都能利用乙酸钠、丙酸钠、丙酮酸钠, 这说明木麻黄Frankia菌株之间对有机酸的脱羧作用比较一致。部分参试菌株对酪蛋白、牛肉膏等有机氮和对硫酸铵、硝酸盐等无机氮都能良好利用, 而一些菌株则只能利用某一种氮源, 这显示出木麻黄Frankia在氮源利用上的差异性。参试菌株在氮源缺乏环境中均能良好生长, 这表明内生菌在无氮源环境下能够自行固氮, 为菌丝体生长提供氮源, 这一结论可以在无氮诱导的离体培养菌丝体中检测到固氮酶活性试验得到证实。

所有参试木麻黄Frankia菌株都不能产生纤维素酶, 不利用苯丙氨酸, 能水解尿素, 部分菌株还可以水解酪素, 还原硝酸盐。各种生理类群的木麻黄Frankia菌株在碳源和氮源利用、有机酸羧化、代谢酶产生等方面没有明显的对应关系, 表现出明显的个体差异和丰富的生物多样性。

离体条件下木麻黄Frankia菌株的固氮活性差异显著, 这种差异与泡囊的数量变化相对应。该结果与其它研究结论一致, 即固氮酶活性与泡囊的存在呈正相关(Meeaters et al., 1985; Tisa et al., 1987; Tjepkema et al., 1980)。不少试验已经证实了固氮酶位于泡囊上, 其活性随着泡囊的发展增大(Noridge et al., 1986; Tisa et al., 1987)。

Frankia具有跨越科属侵染植物结瘤的特性, 与根瘤菌宿主专一性强相比有显著不同。本试验参试木麻黄Frankia菌株可以在木麻黄属内种间进行交叉感染, 一些菌株能侵染杨梅、沙枣和四川桤木, 但一些则不能感染杨梅或沙枣结瘤。关于Frankia宿主特异性, Baker建立的宿主特异类群划分获得普遍认可(Baker, 1987)。他根据交叉侵染试验结果将Frankia分为4个类群:第1类群为侵染桤木属(Alnus)、香蕨木属(Comptonia)和杨梅属(Myrica)植物, 第2类群侵染木麻黄科(Casuarina)和杨梅属植物, 第3类群感染胡颓子属(Elaeaguns)和杨梅属植物, 这三个类群的菌株同时还侵染Gymnostoma属的宿主植物, 第4类群菌株只能侵染胡颓子属植物。Torrey等(1989)总结了20株木麻黄内生菌、1株异果木麻黄(Allocasuarina lehmannia)内生菌和1株裸孔木麻黄(G. papuanum)内生菌的宿主特异性:能感染原宿主木麻黄但不能侵染沙枣或水牛果(Shepherdia angentea); 不能侵染原宿主木麻黄, 但可以侵染沙枣或裸孔木麻黄, 所有试验木麻黄菌株均可侵染甜香杨梅(M. gale)和蜡杨梅(M. cerifera)。Du等(1992)对来自中国、泰国和澳大利亚的7株木麻黄Frankia菌进行了宿主侵染特性研究, 结果与Torrey等(1993)相同。本研究结果表明, 来自中国福建、广东的木麻黄Frankia菌株, 除了有以上相同的侵染结果外, 还有不同之处:一些木麻黄菌株能侵染桤木, 但不能感染杨梅。这一结果初步反映出我国南方木麻黄Frankia菌的宿主侵染特性多样化。由于本研究用于跨科属侵染试验的菌株数量较少, 我国木麻黄Frankia菌株的宿主侵染特性将有待于进一步深入了解。