植物细胞能通过多种途径, 如分子氧单电子还原过程、某些酶催化过程和某些低分子化合物的自动氧化, 不断地产生、H₂O₂、·OH和¹O₂等活性氧。在正常情况下, 植物体内活性氧的产生和清除处于平衡状态, 不会导致植物细胞伤害。但在逆境条件下, 这种平衡往往遭到破坏而有利于活性氧产生, 所积累的活性氧会引发或加剧细胞膜脂过氧化, 造成膜系统的损伤, 严重时导致细胞死亡。植物在逆境条件下的膜脂过氧化反应和保护酶系统超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化物酶(POD)、过氧化氢酶(CAT)、抗坏血酸过氧化物酶(AsA-POD)、谷胱苷肽还原酶(GR)活性的变化以及膜脂过氧化物质丙二醛(MDA)含量的变化等已有报道(Bowler et al., 1992; 陈立松等, 1998a; 1998b), 目前有关铝胁迫对活性氧代谢影响的研究鲜见报道, 因此本文探讨铝胁迫对龙眼(Dimocarpus longan)活性氧代谢的影响, 阐明铝胁迫下活性氧对龙眼细胞的伤害。

1 材料与方法 1.1 材料

供试材料为福建龙眼主栽品种乌龙岭7个月苗龄的实生苗, 苗木从圃地取出移入培养液中经过2个月恢复培养后于2001年7月开始进行铝胁迫, 水培试验营养液采用李延¹⁾的配方, 用1/4浓度进行培养, 容器采用外壁漆黑的塑料桶, 每桶3株, 每桶装培养液5 L, 每14 d更换1次培养液, 更换培养液时调节pH至4.2, 每天定时通气3次, 每次20 min。采用随机区组设计, 铝(Al³⁺)浓度设0(CK)、0.185、0.370、0.740、1.110、1.850 mmol·L^-16个处理, 重复5次, 每个处理共15株。铝胁迫采用营养液中加铝的方法进行, 铝源用AlCl₃·6H₂O。胁迫5个月后采集叶样供活性氧代谢中相关酶类和相关物质含量的测定。

1) 李延.龙眼缺镁胁迫生理及调控技术研究.福建农业大学博士学位论文, 1999

1.2 方法 1.2.1 采样方法

采样在早晨7:30—8:30之间进行。叶样均取自小苗顶端向下第2至第4片复叶。

1.2.2 细胞膜透性

称取0.25 g左右直径为1.0 cm的龙眼叶圆片(20片), 置于20 mL去离子水中, 抽气20 min, 使叶圆片浸没于水中, 在25 ℃培养箱中振荡培养4 h后, 用HITACHI Z-6100原子吸收光谱仪测定K含量, 用HITACHI-3210分光光度计测定OD₂₅₄, 得到大分子总渗漏值。

1.2.3 酶液提取

称取叶样1.0 g, 分次加入5.0 mL 62.5 mmol·L^-1pH 7.8 PBS(含1 %PVP), 于冰浴上匀浆, 15 000×g、4 ℃下离心20 min, 上清液用于酶活性及MDA含量的测定。酶液中蛋白质含量用Bradford(1976)方法测定, 以牛血清蛋白作标准曲线。

1.2.4 MDA含量的测定

参照刘祖祺等(1994)的方法进行。取酶液2.0 mL, 加入2.0 mL 10 %TCA(含0.5 %TBA)混匀, 沸水浴15 min后快速冷却, 4 000 ×r·min^-1离心20 min, 以10 %TCA(含TBA)为参比, 上清液在532和600 nm处测定OD值。

1.2.5 H₂O₂、含量的测定

H₂O₂参照Patterson等(1984)的方法测定, 参照王爱国等(1990)方法进行。

1.2.6 细胞保护酶活性的测定

SOD按Giannopolitis等(1977)的方法、CAT参照Klapheck等(1990)的方法、AsA-POD参照Nakano等(1981)的方法、GR参照Dhindsa(1991)的方法、POD参照刘祖祺等(1994)的方法测定。

1.2.7 AsA和GSH含量的测定

1 g样品加入适量预冷的5 %TCA溶液, 在冰浴中研磨成匀浆, 15 000 × g下离心15 min。AsA含量测定:参照Arakawa等(1981)的方法进行, 取上清液1 mL加入1 mL 5 %TCA、1 mL EtOH(乙醇)、0.5 mL 0.4 %H₃PO₄-EtOH、1 mL 0.5 %邻菲啰啉-EtOH和0.5 mL 0.03 %FeCl₃-EtOH, 在30 ℃下反应90 min, 在534 nm下测定OD534, 根据AsA标准曲线计算AsA含量。GSH含量测定:取上清液0.5 mL, 加入PBS(pH 8.0)2 mL, 蒸馏水1.5 mL, 以DTNB(2, 2 -硝基-5, 5 -二巯基苯甲酸)显色, 测定OD₄₁₂, 根据GSH标准曲线, 计算GSH含量(Ellman, 1959)。

2 结果与分析 2.1 铝胁迫对龙眼叶片细胞膜透性的影响

植物组织在受到逆境伤害时, 膜透性增加, 细胞内物质大量渗出(图 1、2)。铝胁迫下, K⁺和大分子渗漏值随铝胁迫浓度的增加而增加, K⁺渗漏值单位叶面积增加了1.3 ~ 13.9 μg, 增加幅度达到12.16 % ~ 132.35 %; 大分子渗漏值增加了10.43 %~ 100.08 %。可见随着铝胁迫浓度的增加, 细胞膜受到的伤害也越严重, 从而使膜透性不断增加。

2.2 铝对丙二醛(MDA)含量的影响

MDA含量是反映膜脂过氧化强弱的重要指标。铝胁迫下, MDA含量显著提高(图 3), 与对照相比较, MDA增加了5.85 %~ 89.54 %, 且随铝胁迫浓度的提高, 增加幅度不断提高。可见, 铝胁迫导致膜脂过氧化, 破坏了质膜的完整性, 导致K⁺和大分子物质大量外渗(图 1、2), 铝浓度越高, 膜脂过氧化程度越高, 质膜破坏越严重。MDA含量与K⁺、大分子渗漏值之间呈极显著正相关, 相关关系为:y(MDA)= 2.320 3x(K⁺渗漏值)+12.261 (R =0.97^**), y(MDA)=43.334x(大分子渗漏值)+4.324 6(R = 0.98^**)。

2.3 铝对H₂O₂含量和产生速率的影响

铝胁迫下, 龙眼叶片超氧自由基产生的速率和H₂O₂含量都明显提高(图 4、5), 产生的速率提高了44.49 %~ 443.48 %, H₂O₂含量增加了0.62 %~ 58.36 %, 产生的速率提高的幅度大大高于H₂O₂含量增加的幅度。由此可见, 铝胁迫导致膜脂过氧化的主要原因是迅速增加, 直接启动膜脂过氧化, 也可通过一系列的反应衍生为H₂O₂、羟自由基(·OH)、单线态氧(¹O₂)等氧自由基, 间接地启动膜脂过氧化。通过MDA含量与H₂O₂含量、产生速率之间的相关分析也可以证明这一点, MDA含量与H₂O₂含量、产生速率之间呈极显著的正相关:y(MDA)=1.265 3x(H₂O₂)-14.631 (R = 0.98^**), y(MDA)=6.562x(产生速率)+29.11(R =0.97^**)。

2.4 铝对龙眼叶片AOS清除系统中保护酶活性的影响

表 1可见, 铝胁迫下, SOD、POD、GR的活性随铝胁迫浓度的增加而增加, 至0.370 mmol·L^-1铝处理时达最大值, 当铝浓度>0.370 mmol·L^-1时, 则不断下降。0.185、0.370、0.740 mmol·L^-1铝处理使得SOD活性分别比对照增加29.95 %、32.60 %、16.89 %, 而1.110、1.850 mmol·L^-1铝处理则使得SOD活性分别比对照下降1.82 %、13.88 %。但铝胁迫各处理POD、GR的活性比对照都有所增加, SOD增加2.9 %~ 32.60 %, POD增加4.82 %~ 106.6 %, GR增加8.68 %~ 104.18 %。CAT活性在铝胁迫下呈不断下降的趋势, 与对照比, 下降11.12 %~ 63.27 %。相反, AsA-POD活性则呈不断增加的趋势, 各处理比对照增加51.24 %~ 105.29 %。

2.5 铝对龙眼叶片AsA和GSH含量的影响

AsA和GSH是植物体内普遍存在的抗氧化物质。铝胁迫下, AsA含量呈不断下降的趋势, 与对照相比较, 下降了13.95 %~ 40.47 %, 铝胁迫浓度越高下降幅度越大(图 6)。而GSH含量随铝胁迫浓度的提高而增加(图 6), 至0.740 mmol·L^-1铝处理时达最大值, 铝浓度大于0.740 mmol·L^-1时GSH含量不断下降。但与对照比, 铝胁迫除1.85 mmol·L^-1铝处理比对照降低2.60 %外, 其余各处理均比对照增加, GSH含量增加了17.75 %~ 58.01 %。

3 讨论

铝胁迫导致植物细胞最直接最明显的伤害是:细胞膜结构和功能遭到破坏, 透性增大, 膜的稳定性降低, 细胞内的离子、糖类、氨基酸等被动外渗, 影响植物代谢, 这已在马尾松(Pinus massoniana)(曹洪法等, 1992; 高吉喜等, 1992)、小麦(胡红青等, 1995; 黄巧云等, 1994)、水稻(王建林, 1991)等植物上得到证实。铝胁迫下龙眼叶片细胞膜脂过氧化加剧, 膜脂过氧化的产物MDA显著增加, 铝胁迫浓度越大, 增加幅度越大, 可见铝胁迫浓度越大, 膜脂过氧化越严重。膜脂过氧化导致膜伤害, 膜透性明显提高, K⁺、大分子渗漏值增加。导致膜脂过氧化的原因是超氧自由基、H₂O₂等氧自由基的大量累积, 说明铝胁迫破坏了AOS产生和清除系统的平衡, 从而导致AOS的累积。从MDA含量与H₂O₂含量、产生速率之间的相关分析也可以看出这一点, MDA含量与H₂O₂含量(R =0.97^**)、产生速率(R =0.98^**)之间呈极显著的正相关。植物组织在逆境胁迫下产生并积累了大量的、H₂O₂、¹O₂、·OH等活性氧, 这些活性氧可直接攻击膜系统的不饱和脂肪酸, 从而导致了膜脂过氧化, 诱发脱脂化, 降低了膜的流动性, 增加细胞膜的透性(陈少裕等, 1991; 姚允聪等, 1993; 陈立松等, 1998a; 1998b;李晓玲等, 1999), 从而造成植物的伤害。、H₂O₂等自由基可直接启动膜脂过氧化(晏斌等, 1995), 也可通过Fenten型和Haber-Weiss型反应, 产生氧化力更强的·OH, 从而启动膜脂过氧化(蒋明义等, 1993)。另外逆境条件下AOS造成叶绿体、线粒体结构和功能的损伤, 还直接攻击核酸、蛋白质等生物功能分子(李晓玲等, 1999; 蒋明义等, 1996b; 王爱国等, 1993)。

导致龙眼幼苗叶片、H₂O₂等AOS的累积和膜脂过氧化加剧的另一个主要原因是铝胁迫破坏了细胞保护酶和抗氧化物质系统的协调性, 使活性氧防御系统失衡, 从而导致AOS的累积和植株的伤害。

SOD的作用是将歧化为H₂O₂, 在各种酶促AOS清除系统中处于第一道防线。在许多逆境中如高光强、日灼、光抑光合、氧抑光合、低温胁迫等(李晓玲等, 1999), 均证实了SOD对膜伤害起着保护作用。铝胁迫下龙眼幼苗叶片SOD活性随铝胁迫浓度的提高而上升, 至0.370 mmol·L^-1铝处理时达最大值, 而后不断下降, 铝浓度≤0.740 mmol·L^-1时SOD活性比对照上升16.89 %~ 32.60 %, 铝浓度>0.740 mmol·L^-1时SOD活性比对照下降1.82 %~ 13.88 %。铝胁迫下SOD活性的升高, 可以认为是龙眼植株对铝胁迫下迅速增加的一种自我保护的反应机制, 而高浓度铝胁迫导致SOD活性的下降, 是植株受到严重伤害的一种标志, 因为此时的清除机制受到削弱。

CAT和POD是植物体内担负清除H₂O₂的主要酶类, 它们可把H₂O₂变为H₂O。通过SOD、CAT、POD三者协调一致的作用, 可使AOS维持在一个较低的水平。铝胁迫下龙眼幼苗叶片CAT活性不断下降, 比对照下降11.12 %~ 63.27 %; 低浓度铝胁迫时POD活性增加, 至0.370 mmol·L^-1铝处理时达最大值, 当铝浓度>0.370 mmol·L^-1时, 则逐渐下降, 但其活性在铝胁迫各处理中均比对照增加。CAT、POD的这种变化规律与Subrahmanyam等(1998)对四季豆的研究结果相似。相关分析表明, 龙眼叶片细胞H₂O₂的累积与CAT活性呈显著的负相关, 相关关系为y(H₂O₂)=-0.113 x(CAT)+77.94(R =-0.98^**), 因此至少可以看出H₂O₂与CAT活性的下降密切相关。

AsA-POD和GR均为叶绿体中清除H₂O₂的重要酶。AsA-POD是叶绿体中专一地清除H₂O₂的关键酶(蒋明义等, 1996a)。GR则与AsA-POD、DHAR(脱氢抗坏血酸还原酶)等酶一起通过抗坏血酸-谷胱苷肽循环(又称Foyer-Halliwell-Asada循环)移去叶绿体中的H₂O₂, 同时可使植物体内的2种重要的氧化物质AsA和GSH得以再生(蒋明义等, 1996a; 秦小琼等, 1997)。铝胁迫下, 龙眼叶片AsA-POD活性则呈不断增加的趋势, 各处理比对照增加51.24 %~ 105.29 %, GR活性随铝胁迫浓度的变化规律与POD相似, 铝胁迫各处理GR的活性比对照均有所提高, 这可能是叶绿体系统对铝胁迫的一种适应。AsA和GSH均为植物体内有效的抗氧化剂。本试验结果表明, 铝胁迫导致AsA含量不断下降, 铝胁迫浓度越大下降幅度越大, 本结果与陈立松等(1998a;1998b)研究结果相似。这与AsA还原(二级速率常数为2.7 ×10⁵ L·moL^-1s^-1), 清除·OH(二级速率常数为7.2 ×10⁹ L·moL^-1s^-1), 猝灭¹O₂(猝灭速率常数为1.0 ×10⁷L·moL^-1s^-1)及歧化H₂O₂, 还可再生VE(一种强有力的中断链式反应的抗氧化剂)等有关。GSH可直接或通过Halliwell-Asada途径清除H₂O₂, 修复自由基损伤, 防护脂质过氧化物造成的损伤, 亦可非酶促地与、¹O₂、·OH反应(蒋明义等, 1996a)。GSH含量随铝胁迫浓度的增加而增加, 至0.740 mmol·L^-1铝处理时达最大值, 而后不断下降。由此可见铝胁迫下、H₂O₂等AOS的累积与AsA含量下降有关, 而GSH含量的增加可能是植株对铝胁迫的一种反应, 但高浓度铝胁迫下GSH含量的下降可能是植株受到明显伤害的标志。