蒙古栎(Quercus mongolica)为落叶栎中抗逆性较强的一个种，主要分布于我国的东北和华北地区，是东北夏绿阔叶林的重要建群种；辽东栎(Q.liaotungensis)主要分布于暖温带北部落叶林亚地带，是华北暖温带落叶阔叶林的主要建群种(马恩伟，1990)，这2个种是温带和暖温带地区重要的生态经济树种和造林树种(吴征镒，1980；郑万钧，1985)。这2个树种在形态学、细胞生物学、生态学等方面已有较多研究。张金谈等(1986)和王良民(1986)研究表明，蒙古栎、辽东栎的花粉及核型显微结构略有差异，但与其它落叶栎差异明显。这2种栎树形态特征相似，虽有一定差异，但其分布区重叠，多出现在同一地区，鉴定和区分它们非常不易(唐宇丹等，1999)。对这2个种遗传多样性及其种间关系研究较少，恽锐等(1998)利用同工酶和RAPD技术研究了蒙古栎和辽东栎遗传多样性以及遗传分化，认为2种栎树遗传分化较少，东灵山群体是典型蒙古栎群体和辽东栎群体的中间类型。夏铭等(2001)利用RAPD方法对中国东北地区4个蒙古栎天然群体的研究表明，蒙古栎遗传多样性水平较高(Shannon多样性指数I=1.298)，群体间遗传分化较高(遗传分化系数Gst=0.355)。李文英等(2003)对中国蒙古栎分布区内(从黑龙江大兴安岭到河北赞皇)8个群体和北京东灵山辽东栎群体的等位酶研究表明，蒙古栎群体遗传多样性为中等水平，平均杂合度(He)为0.085，群体间遗传分化中等偏高(Gst=0.107 6)。由于上述研究仅局限于某一地区，或分析的样本量少以及研究方法的局限性，不足以代表蒙古栎的遗传多样性，而且东灵山群体是蒙古栎还是辽东栎尚处于争论之中(恽锐等，1998)。本研究尝试利用AFLP分子标记技术，以蒙古栎全分布区内地理跨度较大的黑龙江嘉荫群体、内蒙古大青沟群体、河北雾灵山群体以及北京东灵山辽东栎群体为研究对象，研究蒙古栎、辽东栎群体间、群体内遗传多样性分布，探讨DNA分子水平上这2种栎树种内、种间遗传多样性差异，以加深对东灵山群体与典型蒙古栎关系的认识，为栎属种质资源的保护和利用以及生物分子进化和物种分化提供基础资料和实验依据。

AFLP是一种新近用于群体分子生态、群体遗传研究的有效方法(Zabeau et al.，1993)，特别是近几年在种群生态、作物品系鉴别、基因定位作图、遗传多样性研究等方面表现出广泛的应用价值。AFLP标记是显性标记，且按典型的孟德尔方式遗传，迄今为止，已利用AFLP技术对栎属(Quercus)、杨属(Populus)、大叶相思(Acacia auriculiformis)等树种群体遗传结构与种间、种内遗传多样性进行了广泛的研究(Cervera et al.，2000；2001; 张军丽，2001)。该技术不但具备了其它DNA分子标记，如RFLPs、SSRs、RAPD所具有的优点，而且还具有带纹丰富、用样量少、灵敏度高、快速高效等特点(Ajmone et al.，1998; Powell et al.，1996; Hill et al.，1996)，一次分析可获得基因组大量的遗传信息，并表现大量的多态带，特别是对具亲缘关系及遗传上区别不大的种类来说是比较合适的分子标记方法(Powell et al.，1997)。

1 材料与方法 1.1 材料

在蒙古栎分布区内，选择位于黑龙江省小兴安岭嘉荫(130°31′E，48°44′N，海拔320 m)、内蒙古自治区通辽市大青沟自然保护区(122°14′E，42°46′N，海拔120 m)和河北省雾灵山(117°26′E，40°32′N，海拔1 150 m)的3个蒙古栎群体以及北京东灵山(115°26′E，40°00′N，海拔1 100 m)的1个辽东栎群体共计4个群体作为研究对象，每个群体选择24个植株，群体内每2个植株间距保持在30~50 m之间。于2001年9月从选定的每株树上剪取带有饱满顶芽和侧芽的10~15 cm长的枝条，立即装入预先放有湿润滤纸的塑料袋内，带回实验室置于-4℃冰箱内保存。将去掉芽鳞后的顶芽在硅胶中快速干燥后备用。

1.2 总DNA制备

采用改进的CTAB法(Doyle et al.，1987; 邹喻苹等，2001)从硅胶干燥好的蒙古栎冬芽中提取总DNA。将提取出的总DNA溶于0.1×TE [1 mmol·L^-1 Tris-HCl(pH 8.0)，0.1 mmol·L^-1 EDTA(pH 8.0)]中，标定浓度后用于AFLP-PCR扩增。

1.3 AFLP实验 1.3.1 接头和引物

利用PE Applied Biosystems公司的试剂盒及其实验指南进行。从24对AFLP引物中筛选出能获得清晰条带、反应稳定的4对引物(E-AGG/M-CAA，E-AGG/M-CTA，E-ACA/M-CAC，E-ACA/M-CTG)进行AFLP标记分析。

1.3.2 酶解与连接

各样品基因组DNA的酶切和接头的连接在同一反应中进行。在11.0 μL反应体系中含1.0 μL的5 μmol EcoR I接头，1.0 μL的5 μmol Mse I接头，200~300 ng总DNA，6~7 U T4连接酶，50 U EcoR I，1 U Mse I，室温下(约20~22℃)过夜后，加入189 μL的0.1×TE溶液进行稀释，作为预扩增反应用工作液。

1.3.3 AFLP-PCR扩增反应

在20 μL的预扩增反应体系中含有15 μL PE core mix，1.0 μL的5 μmol Primer E，1.0 μL的5 μmol Primer M，3 μL酶解和连接处理后的预扩增反应用DNA工作液，1 U Taq DNA聚合酶。预扩增反应条件为：70℃ 3 min；94℃变性2 min，56℃ 30 s，72 ℃延伸2 min，34个循环；60℃保温30 min；4℃保温5 min。取10 μL预扩增产物，用0.1×TE溶液稀释20倍，置于-20℃冰箱内保存，作为下一步选择性扩增反应用工作液。

选择性扩增反应选用PE公司的荧光引物如表 2和表 3所示。在20 μL的选择性扩增反应体系中含有15 μL PE core mix，1.0 μL的5 μmol Primer E，1.0 μL的5 μmol Primer M，3 μL选择性扩增反应用DNA工作液(预扩增产物稀释液)，1 U Taq DNA聚合酶。PCR反应条件为：70℃ 90 s；94℃变性150 s，66℃ 30 s，72℃延伸2 min，28个循环；60℃保温30 min；4℃保温。

AFLP标记的PCR扩增在T-personal 48型PCR仪(Biometra^®，made in Germany)上薄壁管中进行。

1.3.4 AFLP选择性扩增产物的检测

取2 μL选择性扩增产物样品，在377 DNA自动测序仪(ABI Prism^TM 377 DNA Sequencer)上，在5%聚丙烯酰胺凝胶上电泳2.4 h，在Run Module：GS Run 36F-2400下，自动采集电泳胶图。

1.4 数据分析

利用GeneScan 3.1b软件将96个个体、4对荧光引物产生的电泳胶图转换为一个0，1矩阵，用POPGENE version 1.32软件(Nei，1987)计算以下遗传多样性各参数：(1)多态带数AP(number of polymorphic loci)和多态带百分率P (proportation of polymorphic loci)；(2)等位基因平均数A (average number of alleles per loci)；(3)有效等位基因数Ae (effective number of alleles per loci)；(4)Nei基因多样性指数H (gene diversity)，Shannon信息指数I(Shannon's information index); (5) Nei的遗传距离D(genetic distances)和遗传一致度I_N(genetic identity)，并采用Nei的遗传一致度I_N进行非加权算术平均聚类分析(unweighted pair group with arithmetic average，UPGMA)(Sun et al.，1997)；(6)应用Nei(1973)基因多度法计算遗传分化度Gst(the coefficient of gene differentiation among populations within species)，其关系式为Gst=Dst/H_T，其中H_T=H_S+Dst，H_T为总遗传多样性，H_S为群体内的遗传多样性，Dst为群体间遗传多样性；(7)按照Wright(1951)的方法计算反映基因流强度的群体每代迁移数(N_m)，其关系式为：Fst=1/(1+4N_m)，N_m=(1-Fst)/4Fst，在此，Fst值等同于Gst。

AMOVA(analysis of molecular variance)是一套适合于单套基因组(haplotype)或RAPD的遗传计算程序，现在也用于AFLP等以0/1计数的表型扩增带的遗传变化分析。利用AMOVA version 1.55(Excoffler et al.，1992)软件进行分子方差分析，计算反映群体遗传结构及变化的平方和、均方、方差分量以及遗传距离Φst。

2 结果 2.1 AFLP扩增片段的多态性

在扩增片段长度70~400 bp的范围内，其中300~400 bp的片段较多。96个个体经过4对荧光引物扩增共获得351条清晰的谱带，其中多态带346条，多态位点百分率为98.6 %。每对引物扩增出63~112条多态带，平均87.75条(表 1，图 1)。

AFLP扩增片段在不同群体中出现的频率有差异，如B7-2-118位点在大青沟、雾灵山、东灵山3个群体中的频率均为1，而在嘉荫群体中的频率为0.711 3；G6-1-88位点在东灵山群体的频率为0，而嘉荫、大青沟、雾灵山群体的频率分别为0.158 4、0.158 4、0.087 1。根据不同群体在同一位点频率的差异，统计了4个群体的特有带数及群体间共有带数(表 2)。从4个群体所具有的特异扩增带来看(表 2)，4个群体特异带占多态带总数的2.31%~3.47%，2个群体共有带比例为11.85%~17.05%，3个群体共有带比例为8.91%~14.16%，4个群体的共有带为145个，占多态带总数的41.91%，群体特异带及群体间共有带的不同揭示了各群体间的遗传差异及遗传相似性，可为遗传资源的保护和利用提供依据。

2.2 群体遗传多样性参数

多态位点百分率(P)是目前应用较为广泛的多样性指标，在4个群体中，大青沟群体的P最高，嘉荫群体的P最低(表 3)，按所检测的多态位点丰富程度，4个群体的排序为：大青沟群体(P=71.7%)>东灵山群体(P=67.6%)>雾灵山群体(P=69.9%)>嘉荫群体(P=65.9%)。

Shannon信息指数(I)分析结果显示，以雾灵山群体最低，大青沟群体最高，4个群体的排序为：大青沟群体(I=0.238)>东灵山群体(I=0.220)>嘉荫群体(I=0.216)>雾灵山群体(I=0.208)。蒙古栎种级水平的I为0.246，群体内的平均I为0.221，群体间遗传多样性和群体内遗传多样性分别占总遗传多样性的10.36%和89.64%，群体内遗传多样性大于群体间遗传多样性。

Nei基因多样性指数(H)是衡量群体遗传分化最常用的指标，表示在总的遗传变异中群体间变异所占的比例。本研究结果显示，大青沟群体具有稍高的Nei基因多样性，雾灵山群体的最低(表 3)，4个群体的Nei基因多样性指数依次为：大青沟群体(H=0.145)>东灵山群体(H=0.134)>嘉荫群体(H=0.132)>雾灵山群体(H=0.125)。蒙古栎种级水平的H_T为0.145，群体内平均H_S为0.134，群体间的遗传分化指数Gst为0.077，即群体间的遗传变异占总变异的7.70%。由此可见，Nei基因多样性指数和Shannon信息指数的AFLP统计结果，都显示出蒙古栎遗传多样性主要存在于群体内。

对蒙古栎种级水平的AFLP检测表明，每个位点的等位基因数(A)为1.968，多态位点(P)占96.8%，Shannon信息指数(I)为0.246 (表 3)。在蒙古栎群体水平，上述指标要低得多，A、P、I范围分别为：1.659~1.717，65.9%~71.7%，0.208~0.238。东灵山辽东栎群体的遗传变异水平为：P为67.6%，A为1.676，Ae为1.207，H为0.134。东灵山群体的AFLP遗传多样性各参数与蒙古栎非常相近，但在DNA水平上未检测到明显的遗传差异。

2.3 群体遗传变异的AMOVA分析

群体遗传变异的AMOVA分析表明，群体间差异极显著(P＜0.001)。研究群体的遗传多样性主要分布在群体内，占变化成分的94.11%，而只有5.89%分布在不同群体间，即群体间的分子分化不到总遗传多样性的6%(表 4)。3个不同蒙古栎群体与辽东栎群体两两间的Phist遗传分化(Φst)也不大(表 5)。从4个不同群体间的AMOVA遗传多样性及遗传分化的Φst值的比较来看，嘉荫群体与雾灵山群体间的遗传结构较远(Фst值较大)，大青沟群体与雾灵山群体间的遗传结构关系较近(Фst值较小)，嘉荫群体与大青沟群体间、东灵山群体与雾灵山群体间的遗传关系介于两者间。

2.4 群体间的遗传一致度和遗传距离

为了进一步分析群体间的遗传分化程度，计算了Nei的遗传一致度I_N和遗传距离D，群体的遗传一致度在0.978 2~0.990 9之间，遗传距离在0.009 2~0.022 0之间，说明群体间的相似程度较高，遗传距离较小。其中，雾灵山群体与大青沟群体之间的相似性最高，遗传距离为0.009 2；雾灵山群体与嘉荫群体之间的遗传距离较大(D为0.022)，遗传分化程度较大。

2.5 群体间遗传关系的UPGMA聚类分析

4个群体间的遗传一致度相当高，均大于0.978。根据4个群体间的遗传一致度进行的UPGMA聚类分析结果显示，雾灵山蒙古栎群体与嘉荫蒙古栎群体间的遗传距离最大，大青沟蒙古栎群体与雾灵山蒙古栎群体间的遗传距离最小，东灵山辽东栎群体与大青沟蒙古栎群体间的遗传距离居中。东灵山辽东栎群体与地理上较远的嘉荫蒙古栎群体聚类在一起(图 2)。

3 讨论 3.1 遗传多样性水平

从蒙古栎群体AFLP检测结果看，用4对AFLP引物共扩增出346条多态带，平均每对引物检测到87.75个多态位点(表 1)，与Cervera(2000)用2对AFLP引物对夏栎(Q. robur)和无柄栎(Q. petraea)的研究得到的平均每对引物检测到80.0个多态带数的结果大体相当，说明本试验选择的AFLP引物扩增的高效性。本研究结果揭示蒙古栎的遗传多样性偏低，平均Shannon信息指数为0.221，平均Nei遗传多样性(H_S)为0.134(表 3)。栎属植物的核遗传多样性水平在长命的木本植物中是最高的，平均杂合度(He)为0.186，显著高于其它树种(Kremer et al.，1991；1993)。Le Corre等(1997)用RAPD对无柄栎21个群体的遗传多样性研究表明，无柄栎群体内的平均遗传多样性(H_S)和总遗传多样性(H_T)分别为0.233和0.239。Greef (1998)用RAPD技术对无柄栎的9株优树193个子代个体的研究表明，H_S为0.298，H_T为0.406。与之相比，蒙古栎的遗传多样性要低于欧洲栎的研究结果，H_S和H_T分别为0.134和0.145，这可能由于现存蒙古栎林多为次生林，长期受人为因素干扰，萌生起源多，甚至为多代萌生林(于顺利等，2000)。无性繁殖也能影响片段化的遗传效应，由于是无性繁殖体，在各无性繁殖世代个体间的基因型基本一致，降低了遗传变异程度，使得群体内的遗传多样性大大降低。本研究表明蒙古栎天然群体遗传多样性偏低，与其天然群体受叠代破坏、存在繁殖群体的繁殖瓶颈效应、现存林分基本上为次生林等有很大关系。

4个群体特异带、群体间共有带数的不同(表 2)，说明不同的环境选择压以及各群体等位基因频率分化有差异。蒙古栎群体(P)平均为67.17%，东灵山辽东栎群体P为67.6%。Gervera(2000)用2对AFLP引物对夏栎和无柄栎的研究表明，种内扩增的多态带比率为54%~56%，种间扩增的多态带比率为58%。在检测到的346个多态带中，东灵山辽东栎有8条带表现为种特异带，占多态带的2.3%，说明这2个近缘种的相似性较高。东灵山群体地处蒙古栎、辽东栎的交界处，是典型蒙古栎群体和辽东栎群体的中间类型(恽锐，1998)，胡志昂(1996)认为蒙古栎、辽东栎从形态、生态上虽有区别，但不是截然分明的2个物种。关于蒙古栎、辽东栎种间关系研究，尚需进一步扩大取样范围深入研究。

3.2 遗传结构与基因流

栎属植物为风媒异交植物，靠重力、风力等传播种子，花粉的长距离传播和后代有限的向外扩展能力，对形成群体遗传结构起着十分关键的作用，并与基因流的强度密切相关。AFLP标记测得蒙古栎遗传多样性主要存在于群体内，群体间占7.7%，3个蒙古栎群体间基因流N_m为5.99，说明蒙古栎不同群体间有一定的基因交流，但不同群体地域上跨越了几个省区，地理隔离大，群体间存在一定程度的遗传分化(Gst为0.077)；另一方面，蒙古栎是生长于演替中后期群落中的种，适于在中生条件下生长(陈大珂，1982)，在分布类型上属于北方狭域类型(刘茂松，1999)，所以群体间分化作用比其它演替早期的物种要低。Nei的遗传多样性分析方法与分子方差分析(AMOVA)得出的研究结果一致，群体内遗传变异大于群体间遗传变异，自然群体间的遗传距离有随地理距离跨度增加而递增的趋势。

3.3 遗传多样性保护

了解物种遗传变异的空间分布格局对于制定科学的保护策略具有重要作用。蒙古栎群体内遗传多样性较高，群体间遗传多样性较低。从群体特异带分布来看，各群体都检测到程度相近的特异带，但所占比例并不大(2.31%~3.47%)，群体间共有带比例相对较大(11.85%~41.91%)，说明每个群体有一定的独特性，可为基因资源的保护和利用提供依据。在就地保护时尽可能在蒙古栎自然分布范围内均匀布点划分保护区域，以利于保护群体的遗传特异性；进行易地保护时应从同一天然群体内选择环境异质性差异较大的地段尽可能多地保存个体，以达到基因资源保护的目的。有关中国蒙古栎遗传多样性分布中心的确定尚需扩大取样群体的数量和规模深入开展研究。