银杏(Ginkgo biloba)是我国特有的孑遗植物。其体内含有大量的具药理作用的化学物质，特别是叶片中含有的黄酮类(flavonoids)和银杏内酯(ginkgolides)等物质，具有改善人体器官扩张、促进血液循环、防止血管老化的功能，因而受到世人关注。尽管对银杏有效成分开发利用的热潮高涨，但有关这些物质在银杏体内的合成部位、富集机理、变化规律等方面的基础研究几乎是空白。已有研究报道，银杏的干、叶、芽鳞、胚等器官内存在着不同长度的分泌腔(道)，且具药理作用的活性物质与内部分泌器官的生长发育存在密切的相关(Alain et al., 1990; Ameele, 1980)。而对于分泌腔的发生、发育的观察结果多年来一直存在分歧。早期一些学者认为银杏分泌腔是溶生发育的(Ameele, 1980)，另外一些学者则认为是裂生的(Wooding et al., 1963)。近年来，人们通过电镜观察得出的结果仍不一致，Alain等(1990)认为是裂溶生的，而Ameele(1980)观察到是溶生的。本文在对银杏不同器官分泌腔的形态特征及其发生发育规律进行初步研究的基础上，利用组织化学方法结合显微和超微结构观察，较为深入地探讨了银杏叶片分泌腔的结构特征及与分泌物产生的关系，旨在为银杏药用资源的开发利用提供理论依据。

1 材料与方法 1.1 试验材料

试验用材料银杏采自南京林业大学试验园内栽培的2~3 a生实生苗和树木园内栽培的成龄植株。于2000年4-11月和2001年4-5月，每隔5~7 d采一次茎尖、幼茎、芽鳞、根、幼叶及成熟叶片样品。

1.2 石蜡切片法

把采集的新鲜样品分割成2~5 mm³小块，FAA或纳瓦兴Ⅲ固定，传统石蜡切片法制片，切片厚6~10 μm，用番红-固绿和铁矾-苏木精2种方法染色，中性胶封片。Olympus研究用显微镜观察和照相。

1.3 半薄切片和超薄切片法

将采集的材料分割成1 mm³小块，用4%戊二醛(pH 7.0磷酸缓冲液配制)在常温下固定3~6 h，磷酸缓冲液冲洗后，用1%锇酸后固定2~3 h，缓冲液冲洗后，系列酒精脱水，环氧丙烷过渡，Epon812环氧树酯包埋，LKB-V型切片机切片，半薄切片厚约2 μm，不经染色或铁矾-苏木精染色，二甲苯透明，中性胶封片。超薄切片用醋酸双氧铀和柠檬酸铅对染，日立H-600型透射电镜观察拍照。

2 结果与分析 2.1 分泌腔发育进程的显微观察

通过对银杏叶、茎、芽的发育过程的连续切片观察，发现分泌腔都是以裂溶生方式发育的。现仅以叶片中分泌腔的发育为例(图版Ⅰ-1)说明分泌腔发生、发育的一般进程。

通过对不同发育时期叶片的连续切片观察，看到叶中分泌腔发生很早。在叶肉细胞还未完全分化的叶原基内即可看到分泌腔原始细胞，根据分泌腔发育过程中不同阶段的结构特征，将其划分为以下几个阶段。

2.1.1 原始细胞团阶段

银杏分泌腔起源于一团圆形至椭圆形囊状结构的排列非常致密的细胞。这些原始细胞与其周围细胞明显不同：位于原始细胞团中央的部分细胞为呈多角形的等径细胞，细胞质浓，染色较深，细胞核大，周围细胞呈圆形或扁长形，细胞高度液泡化(图版Ⅰ-2)。

2.1.2 胞间隙形成阶段

原始细胞团迅速液泡化，中央细胞胞间层膨胀、溶解，形成裂缝状胞间隙，接着胞间隙沿着细胞壁向外扩大，形成一个由4~6个分泌细胞构成的不规则腔。此时，分泌细胞完整，无破裂(图版Ⅰ-3)。

2.1.3 分泌腔扩大阶段

形成腔隙后，周围细胞迅速向四周移动，分泌腔增大。同时，外层鞘细胞继续切向伸长，为分泌细胞向外移动提供了空间(图版Ⅰ-4)。

2.1.4 分泌腔溶解阶段

当分泌腔的腔隙增大到一定阶段后，部分分泌细胞向内突出，个别细胞开始溶解并且脱落于胞间隙中。该过程并不是所有分泌细胞同时参与。分泌细胞呈不规则状，细胞核开始解体，此阶段部分分泌细胞内还可看到细胞核(图版Ⅰ-5)。

2.1.5 分泌腔的成熟阶段

在分化的最后阶段，分泌细胞溶解停止，切向伸长不再进行，腔隙达到最大直径。成熟的分泌腔是由4~6个切向强烈延长的扁长形分泌细胞包围着近圆形的分泌腔道，其外围有2~5层形状与分泌细胞相似的鞘细胞共同组成(图版Ⅰ-6)。

2.2 分泌腔发育过程中的超微结构特征 2.2.1 分泌腔的原始细胞期

通过对叶片分泌腔的超微结构观察表明，在叶肉细胞还未完全分化的叶原基中即出现几个细胞核大、原生质浓厚的分泌腔原始细胞。随后，这些原始细胞通过垂周分裂增加细胞数量，并呈螺旋状排列。以后，外围的细胞平周分裂形成2~3层切向伸长的鞘细胞，其有少量小液泡，细胞核切向扁长形，有的质体内有细长的淀粉粒；而中央的原始细胞呈多角形，细胞核大且圆形，原生质浓厚，几乎没有小液泡，这些细胞通常称为中央分泌细胞。中央分泌细胞内细胞器非常丰富：线粒体很多，具染色较深的基质和明显的脊；内质网分布在整个细胞质中，以光滑内质网为主，偶尔有片段状内质网为粗面内质网；所有分泌细胞团内的细胞质体非常丰富，形状多样，有圆形、椭圆形、哑铃形和长棒状等形态；质体内片层结构不发育或有少量内膜，几乎没有淀粉粒，高尔基体少数，位于细胞壁附近，两端没有分泌小泡(图版Ⅰ-7)。

2.2.2 分泌腔形成时期

当形成分泌腔的原始细胞分化为鞘细胞和中央原始细胞后，很快位于中央的几个相邻细胞之间的细胞壁胞间层开始膨胀，溶解，形成一个沿细胞壁各向的缝隙状的胞间裂隙，以后随着胞间层的继续溶解，细胞彼此分离，分泌腔进一步扩大(图版Ⅰ-8，9)。

在分泌腔沿着细胞壁各向扩展，增大腔隙直径的同时，中央的一些细胞结构发生变化，出现即将溶解退化细胞的特征：细胞染色很深，细胞器不明显，但可见到质体和线粒体的轮廓，质体基质溶解，内膜结构消失，细胞核解体，核膜消失，整个核质呈弥散状，可见核仁(图版Ⅱ-1，2)，在退化细胞的细胞质、质体和液泡内有非常丰富的黑色嗜锇物质。

随着分泌腔的扩大，分泌细胞呈径向柱形排列(图版Ⅱ-1)。径向壁胞间层膨胀并溶解，壁内物质释放于腔隙内，此时腔隙内有大量的黑色嗜锇物质。同时，分泌细胞切向伸长以增大腔的直径。在靠近腔隙一侧的分泌细胞壁内、外侧分布有大量的嗜锇物质(图版Ⅱ-7，8)。

当分泌细胞直径增大到一定程度时，分泌腔周围的细胞明显分为3层，最内层细胞径向较窄，但染色最深，其外1~3层细胞染色稍浅，外围的细胞表现为液泡化的细胞，染色很浅。最内层有的细胞结构退化，黑色嗜锇物质增多，内、外切向壁均不规则向腔内和鞘细胞内突出，这些细胞可能会溶解，脱落(图版Ⅱ-6，8)。

2.2.3 分泌腔成熟期

当分泌腔成熟时，细胞溶解停止，腔隙达到其最大直径。成熟的分泌腔是由4~6个切向强烈延长的扁长形分泌细胞包围着近圆形分泌腔，有的分泌细胞切向长达80~120 μm，其外围有2~3层形状与分泌细胞相似的鞘细胞共同组成(图版Ⅱ-3)。此时，分泌腔内有一些被锇酸染成灰黑色物质。分泌细胞染色仍然较深，但细胞器减少，在有分泌物一侧的分泌细胞内有大量内质网，出现液泡，质体内出现少量淀粉粒，嗜锇物质大大减少。鞘细胞液泡化明显，质体内有较多的淀粉粒。鞘细胞以外的细胞呈典型的薄壁组织细胞(图版Ⅲ-1)。

2.3 与分泌细胞分泌物质有关的超微结构特征

银杏分泌腔分泌物质的多少与其发育阶段有关，不同的发育时期，其分泌细胞内的超微结构特征不同。在分泌腔发育早期，分泌细胞内分布有大量的质体，形状多样，椭圆形、圆形、哑铃形、棒状等(图版Ⅰ-8，9，Ⅱ-1)。随着分泌腔的发育，质体形状多为圆形或长椭圆形，少数扭曲变形为不规则状，基质中出现少量棒状淀粉粒(图版Ⅱ-2，4)。在质体附近和基质内有嗜锇物质(图版Ⅲ-3，4)。高尔基体扁平囊状结构层数较少，排列紧密，早期其周围没有分泌小泡(图版Ⅱ-1)，分泌旺盛时期，高尔基体和其分泌小泡数量均增加，且在高尔基体扁平囊内和附近有黑色嗜锇物质(图版Ⅲ-3)。线粒体也是分泌细胞中常见的细胞器。分泌旺盛期，线粒体脊明显，在其基质中有黑色的嗜锇物质(图版Ⅱ-8)，随着分泌腔的成熟，线粒体数量仍然很多，但其基质内的嗜锇物质显著减少(图版Ⅲ-4)。内质网也广泛分布在整个细胞质中(图版Ⅱ-9)，内质网与质体、质膜相连(图版Ⅲ-1)，在靠近腔一侧的分泌细胞和靠近分泌细胞一侧的鞘细胞的细胞质中分布稍多些(图版Ⅱ-7，Ⅲ-8)。

分泌腔原始细胞的中央分泌细胞的细胞壁很薄，经锇酸染色后呈正常的灰白色(图版Ⅰ-7，8)，当分泌腔隙出现后，面对分泌腔一侧的切向壁电子密度增加，呈黑色(图版Ⅱ-5，图版Ⅲ-8)，由图可看出分泌细胞的外切向壁和径向壁仍呈正常的灰白色。随着分泌腔的成熟，分泌细胞的壁又恢复正常的细胞壁电子密度，靠腔一侧的壁仍然很薄，外切向壁和鞘细胞壁显著增厚(图版Ⅱ-3)。分泌细胞面向腔一侧的壁似乎呈网眼状，分泌物从壁上穿出后，又聚集成泡状结构(图版Ⅲ-1，6)，腔中大量分泌物向腔中央移动(图版Ⅲ-7)，同时小的泡状分泌物彼此融合，最后与中央大的泡状分泌物汇合。

3 结论与讨论 3.1 银杏分泌腔的发生及发育方式

关于银杏不同器官内分泌腔的发生发育方式的争议由来已久，即使近期利用电子显微技术得到的结果仍不一致。本研究和以前的有关研究结果表明，银杏的茎、叶、芽鳞等器官内的分泌腔均以同一方式发生发育——裂溶生(彭方仁等，2001)。首先，原始细胞团中的中央分泌细胞彼此分离，产生一个裂隙，在裂隙沿细胞壁各向延伸扩大的同时，有的中央分泌细胞结构发生变化，呈现出即将溶解的状态，以后这些细胞逐渐解体，释放物质于腔内。随着一些分泌细胞的解体和另一些分泌细胞的切向伸长，同时也有外层鞘细胞插入，分泌腔不断扩大。这与Alain等(1990)的观察结果基本一致。而Ameele(1980)报道银杏小孢子叶内分泌腔是溶生起源。这可能是由于银杏不同器官的分泌腔发生方式不同。因为在观察中发现，同一分泌腔的不同分泌细胞，有的呈解体状态，而有的仍具正常分泌细胞结构特征，执行分泌功能，这表明：细胞的解体状态不是一种切片时机械损伤造成的假象，而是分泌细胞发育过程中一种正常的形态。

3.2 分泌物在分泌细胞中的合成场所

关于银杏分泌腔内分泌物的化学成分已有人做过研究。Scholz(1932)报道了银杏叶片内分泌腔主要含有脂肪、油脂和树脂。Ameele(1980)利用组织化学分析的结果表明：银杏分泌物主要为脂类化合物和果胶，脂类化合物具亲脂的性质，因此遇到锇酸，腔内物质变黑。由于亲脂物质可在电镜制样中被锇酸固定，因此，Alain等(1990)根据银杏组织经锇酸固定后嗜锇物质沉淀发生的位置，提出银杏分泌亲脂类物质的合成作用主要在质体和内质网中进行。

本研究中有关银杏分泌腔的电子显微镜观察表明，在分泌细胞和鞘细胞中都有大量嗜锇物质，后者的嗜锇物质电子密度较高，而且大部分分布于靠近分泌细胞一侧的细胞质中(图版Ⅱ-1)。这些嗜锇物质不仅分布于细胞质中，而且在质体、线粒体、高尔基体、内质网和小液泡内也有分布(图版Ⅲ-2，3，4)。通过对显微照片的分析，发现与嗜锇物质关系最为密切的是质体。质体是分泌细胞和鞘细胞中最丰富的细胞器。在分泌腔原始细胞中，质体数量多，电子密度低，有少量内膜结构(图版Ⅰ-7)，随着分泌腔的增大，分泌细胞的质体电子密度增加，出现嗜锇物质，偶尔看到质体外包围内质网鞘，沿内质网鞘有嗜锇物质分布，同时发现在即将解体细胞中的质体内出现淀粉粒和大量嗜锇物质(图版Ⅱ-2，3)，当分泌腔成熟时，质体内重新出现大量淀粉粒，内膜消失。线粒体在分泌腔发育过程中始终很丰富，尤其在鞘细胞靠近分泌细胞一侧和分泌细胞面向腔道一侧的细胞质中常数个集中成群分布(图版Ⅱ-6，7，8，Ⅲ-3)，它们可能为细胞壁胞间层的降解和以后分泌物的合成或转运提供能量。在线粒体的基质内有嗜锇物质(图版Ⅱ-8)，表明其也可能参与脂类物质的合成。内质网广泛分布于细胞质中，多以片段状分布，其上附着嗜锇物质。高尔基体类囊体内和附近也有嗜锇物质，可能银杏的分泌物合成与转移涉及所有的细胞器。

3.3 分泌物在分泌细胞中的分泌方式

赵桂仿(1990)在研究了漆树乳汁道的亚显微结构后，认为生漆在内质网上产生，以小滴形式接近高尔基体，再由高尔基体包装和运输，然后通过高尔基体小泡或内质网小泡向质膜转移，并与质膜融合，将嗜锇物质释放于质膜外。据报道(刘文哲等，1999；吕洪飞等，1999；施国新等，1988；Fahn et al., 1976)，在各种分泌脂类物质的细胞中，具有丰富的内质网，参与分泌物的合成与运输。本研究中对银杏分泌细胞的观察表明，其内质网不仅与质体有着特殊的联系，而且与质膜、线粒体和高尔基体等细胞器也相接触。可能是分泌物在质体上合成后，通过质体膜转移到周围内质网上，然后以小泡形式靠近高尔基体(图版Ⅱ-6，7)或直接到达质膜(图版Ⅲ-1，6)，与质膜融合将嗜锇物质释放到质膜与细胞壁之间，可能大部分嗜锇滴首先解聚，分解为小颗粒状，同时，靠近分泌腔一侧的细胞壁形成疏松的纤丝结构，成为更易于嗜锇小颗粒运输的通道，接着这些小颗粒不断以扩散形式通过细胞壁向腔内转运(图版Ⅲ-1，6)，并在腔内重新聚合，形成小泡状结构，小泡继续向腔中央移动，形成更大的似网状的具膜包被的结构(图版Ⅲ-7)。在电子显微照片中，正常的分泌细胞的细胞壁与其他薄壁细胞具有同样的电子密度呈灰白色层。但这些壁层在分泌腔一侧电子密度增加，能看到极小的颗粒状嗜锇滴。除了分泌细胞外，在有大量嗜锇物质的鞘细胞中也观察到局部电子密度增加的细胞壁(图版Ⅱ-7，Ⅲ-8)。这种现象在Wooding等(1963)研究意大利松树脂道分泌细胞时曾注意到，他们认为这些壁层在向树脂道一侧逐渐变成较为疏松的纤丝物质网眼，位于质膜外的树脂滴似乎以渗透方式通过这部分细胞壁。在银杏观察到的情况与上述基本相似，因此，银杏分泌腔分泌细胞和鞘细胞中的嗜锇物质均以扩散渗透形式分泌。

图版说明

C. 分泌腔    EC. 分泌细胞    EP. 上皮细胞    Er. 内质网    Gi. 高尔基体    IS. 细胞腔隙    ITW. 内切向壁    M. 线粒体    N. 细胞核    Ne. 核仁    OM. 嗜锇物质    OTW. 外切向壁    P. 质体    PR. 蛋白质    RW. 径向壁    S. 淀粉粒    SH. 鞘细胞    SI. 分泌腔原始细胞    V. 液泡    W. 细胞壁    WC. 解体细胞    

图版Ⅰ

1. 叶内分泌腔的纵切面(×40)；2. 分泌腔原始细胞团(×66)；3. 胞间隙形成阶段(×100)；4. 扩大阶段的分泌腔(×66)；5. 溶解阶段的分泌腔(×66)；6. 成熟的分泌腔(×200)；7. 示原始细胞团的超微结构：细胞核、质体和线粒体(×2 000)；8. 示中央分泌细胞之间产生裂隙(×2 000)；9. 示胞间隙沿细胞壁各向裂开(×2 000)。

图版Ⅱ

1. 示柱形径向排列的分泌细胞(×4 000)；2. 示腔隙增大及中央细胞呈溶解态(×3 000)；3. 成熟分泌腔发育后期(×2 500)；4. 示分泌腔中的嗜锇物质(×6 000)；5. 示成熟分泌腔中分泌细胞的脱落(×3 000)；6. 示分泌腔周围细胞(×3 000)；7. 示分泌细胞径向壁之间的分泌小泡(×15 000)；8. 示线粒体内的嗜锇物质，内质网与质膜、质体相接触(箭头)(× 10 000)；9. 示成熟分泌腔中的内质网(×6 000)。

图版Ⅲ

1. 成熟分泌细胞内内质网、质体和腔内的分泌物(×15 000)；2. 示细胞壁内的嗜锇物质(×15 000)；3. 示高尔基体、内质网和线粒体附近的嗜锇物质(×20 000)；4. 示质体内的嗜锇物质(×10 000)；5. 示分泌腔外各层细胞的特征(×2 000)；6. 示分泌物直接从细胞壁渗透扩散到分泌腔(×20 000)；7. 示大量分泌物向分泌腔中移动(×4 000)；8. 示分泌细胞内切向壁与外切向壁电子密度不同(×8 000)。

Explanation of Plate

C. Secretory cavity    EC. Excrete cell    EP. Epithelial cell    Er. Endoplasmic reticulum    Gi. Golgi body    IS. Intercellular space    ITW. Inner tangential wall    M. Mitochondria    N. Nuclei    Ne. Nucleolus    OM. Osmiothilic material    OTW. Outer tangential wall    P. Plastids    PR. Protein    RW. Radial wall    S. Starch grain    SH. Sheath cell    SI. Secretory cavity initials    V. Vacuoles    W. Cell wall    WC. Wracked cell

Plate Ⅰ

1. The vertical section of secretory cavity in leaf (×40); 2. Secretory cavity initial cell clump (×66); 3. Showing the formation stages of intercellular space in the developing secretory cavity (×100); 4. Showing the secretory cavity in expending stages (×66); 5. Showing the secretory cavity in collapsing stages (×66); 6. Showing the secretory cavity in mature stages (×200); 7. Showing the ultrastructure of initial cell clump including the cell nuclei, plastids and mitochondria (×2 000); 8. Showing the formation of the intercellular space between the central secretory cells (×2 000); 9. Showing the division of intercellular space in radial and tangential (×2 000).

Plate Ⅱ

1. Showing the secretory cells arranged tangentially (×4 000); 2. Showing the autolysis of central secretory cells and the expending of cell space (×3 000); 3. The mature development stages of the secretory cavity (×2 500); 4. Showing the osmiophilic pellets in the secretory cavity (×6 000); 5.Showing the slough off of secretory cells in the mature secretory cavity (×3 000); 6. Showing the neighboring cells in the secretory cavity (×3 000); 7. Showing the secretory vesicles between the radial wall of secretory cells (×15 000); 8. Showing the osmiophilic pellets in mitochondria and endoplasmic reticulum approaching to plasmalimma and plastids (arrowhead)(×10 000); 9. Showing the endoplasmic reticulum in the mature secretory cavity (×6 000).

Plate Ⅲ

1. Showing the secretory products in endoplasmic reticulum, plastids of mature secretory cells and secretory cavity (×15 000); 2. Showing the osmiophilic pellets in cell wall (×15 000); 3. Showing the osmiophilic pellets near the Golgi body, endoplasmic reticulum and mitochondria (×20 000); 4. Showing the osmiophilic pellets in the plastids (×10 000); 5. Showing the out layer cell character of secr etory cavity (×2 000); 6. Showing the secretory products directly percolate through the wall toward secretory cavity (×20 000); 7. Showing a lot of secretory products moving to secretory cavity (×4 000); 8. Showing the different electronic density between the inner tangential wall and outer tangential wall(×8 000).