近年来，已经发现许多逆境因子如高温、低温、干旱、盐渍、大气污染、紫外线、病原菌、活性氧胁迫等，都会引起植物基因表达的变化，使植物体内原来正常蛋白的合成受阻，而诱导产生一类新的蛋白质，即逆境蛋白(stress protein)。虽然这些逆境诱导蛋白的生理功能还不十分清楚，但它们所表现出来的与抗逆性的密切相关引起了人们浓厚的兴趣，因而与之相关的研究工作迅速展开。

许多研究证明，水分胁迫能够诱导植物产生特异性蛋白质，并且也有部分资料报道这些特异性蛋白质产生与植物的生理生化过程变化有关(Vartanin et al., 1987；Rao et al., 1993)。徐恒平等(1992)研究表明，土壤干旱诱导小麦幼苗根系新产生了7条多肽(24、46、61、63、65、69、72kD)。李妮亚等(1997；1998)对萌动的小麦种子进行水分胁迫(-1.2 MPa PEG-6000)处理，24 h以后，诱导小麦幼芽产生41.5kD pI5.65的蛋白，其含量随着胁迫时间延长明显增加，48 h时含量最高，到72 h后不再变化。复水后，该蛋白消失；再胁迫48 h时则又出现，其含量与处理24 h时相当。41kD诱导蛋白主要位于细胞器膜上，细胞质中几乎不存在。沈波等(1996)的研究表明，水分胁迫(-1.75 MPa PEG-6000)处理冬小麦时，产生26kD pI5.8的新蛋白，并且抗旱性不同的品种在受到渗透胁迫时，其诱导蛋白的形成是有差异的。抗旱性强的品种似乎在重度胁迫下能诱导基因更强的表达以适应干旱的环境；抗旱性弱的品种在重度胁迫下丧失自我调节功能，诱导的胁迫蛋白很少。可见在干旱环境下，诱导蛋白的形成因实验材料、胁迫方式、处理时间、器官部位等而异。目前研究较多且较为清楚的是LEA蛋白。Dure(1993)和Bray(1997)分别报道了LEA蛋白的氨基酸序列及部分性质。关于水分胁迫诱导蛋白质性质，结构和功能及细胞内定位尚无统一结论和认识。本文研究干旱胁迫对白桦实生幼苗蛋白质组分的影响，以探讨白桦实生幼苗叶片蛋白质组分与抗旱性的关系。

1 材料与方法 1.1 实验材料及干旱处理

实验材料为1年生白桦(Betula platyphylla)实生幼苗。将供水正常的幼苗停止浇水，自然干旱处理6 d(叶片即将萎蔫，土壤自然含水量约为13.5%)后取样，试样均取自实生幼苗顶端第4~5叶片，3次重复。

1.2 方法

叶片蛋白质提取白桦叶片按适当比例加入蛋白质提取液50 mmol·L^-1 pH 8.0 Tris-HCl(含1 mmol·L^-1EDTA-Na，0.1% β-ME，1 mmol·L^-1 Vc和1% PVP)，于冰浴上研磨，13 000 r·min^-1 4℃离心30 min，上清液加入4倍体积的冷丙酮于-20℃沉淀30 min，12 000 r·min^-1离心30 min，用80%冷丙酮洗数次，于4℃冰箱中沉淀，待丙酮挥发净后，蛋白质沉淀为白色粉末状用于以下SDS-PAGE电泳和IEF-SDS/PAGE电泳。

叶片蛋白质SDS-PAGE方法将上述提取的蛋白质粉末用适量的样品液(62.5 mmol·L^-1 Tris-HCl，pH 6.8，2% SDS，10%甘油，5% 2-巯基乙醇，0.001%溴酚蓝)使其溶解，样品于沸水浴中加热3 min，离心，上样量为15 μL，浓缩胶4%，分离胶15%，电压为120~200 V，电泳在冰箱中进行。电泳时间5~6 h，电泳完毕后，按郭尧君(1999)的银染方法进行染色。

叶片蛋白的双向电泳第一向IEF-PAGE：胶浓度为4%(含9.5 mol·L^-1脲，2% NP-40，2% pH 3.5-10两性电解质，0.25%过硫酸铵，0.006% TEMED)。电泳管底部用Parafilm封口。用含有1% pH 3.5-10 Ampholine的8 mol·L^-1脲的样品覆盖液覆盖，整个过程要避免气泡，室温下聚合3 h后，吸去覆盖液，加入20 μL样品缓冲液(9.5 mol·L^-1脲，2%(V/V)非极性去污剂Nonidet P-40，2% pH 3.5-10 Ampholine及2%2-巯基乙醇)进行预电泳(200 V 15 min，300 V 30 min，400 V 60 min)，阳极槽液为0.1 mol·L^-1磷酸，阴极槽液为0.2 mol·L^-1 NaOH，预电泳后，吸去电泳管内的溶液，加入样品40 μL，再加入20 μL样品覆盖液。重新注满电极液，400 V电泳18 h。等电聚焦电泳后，凝胶条需在5 mL的平衡缓冲液(含有10%(V/V)甘油，5% 2-巯基乙醇，2% SDS，及62.5 mmol·L^-1 pH 6.8 Tris-HCl缓冲液)中平衡30 min。第二向SDS-PAGE电泳：分离胶13%，浓缩胶3%，将平衡后的胶条放在浓缩胶上，用琼脂糖(用平衡液配1%的琼脂糖溶液)封住，避免气泡产生，加上电极缓冲液(含0.025 mol·L^-1 Tris-HCl缓冲液，0.192 mol·L^-1甘氨酸及0.1% SDS)，120~200 V，电泳5~6 h。电泳完毕后，按郭尧君(1999)的方法进行银染。

2 结果与分析 2.1 叶片蛋白质SDS-PAGE图谱上的差异

首先用SDS-PAGE方法初步比较了白桦幼苗叶片在土壤干旱胁迫下与对照之间的蛋白组分的差异。从图 1可看出，大于46.9 kD的多肽无明显变化。在46.9kD到10.3kD之间的多肽变化明显，其中35kD、31kD、27kD、22kD、19kD、10.7kD的多肽带的颜色浅，说明其含量低于对照。干旱诱导出一条29kD的多肽。

1.2 叶片蛋白质IEF-SDS/PAGE图谱上的差异

本试验又通过IEF/SDS-PAGE方法对蛋白组分进行了进一步的分析。由图 2可看出，与对照相比，土壤干旱胁迫引起白桦幼苗叶片蛋白质点的明显变化。有一些蛋白质点的含量显著增加，部分蛋白质点消失或含量减少，同时出现了一些新的蛋白质点。例如：经过胁迫处理后，在12.4~11.5kD pI5.8~6.44之间消失了4个蛋白质点(框1所示)；在框2中10.7kD pI5.72的1个蛋白质点消失，而在30kD~21kD pI 6.0~7.0之间(框3)和41~35kD pI4.68~7.0之间(框4)的蛋白质点，有的为新出现的蛋白质，有的颜色变浅，有的颜色加深。在框5中所示蛋白质点变化尤为明显，对照图谱中等电点相同(pI4.3)而分子量不同(分别为26kD、24.6kD、22kD)的3个蛋白质点，在胁迫处理的图谱中消失，同时在其上方诱导产生2个29kD等电点分别为pI4.3和pI4.2的新蛋白质点。此外，如框6所示，与对照相比，经干旱胁迫处理后，原有的14.9kD pI 5.3和12.6kD pI 5.16的2个蛋白质点的下方产生了2个与原蛋白质点等电点相同而分子量分别为14kD和11.5kD的两个蛋白质点，以上结果与SDS-PAGE所得的在46.9kD到10.3kD之间的蛋白质变化是一致的。由此可见，土壤干旱胁迫可以诱导植物基因表达，即一些与适应水分胁迫有关的基因启动表达，从而引起蛋白质合成的变化并产生水分胁迫蛋白。

3 讨论

李霞等(1993)用PEG溶液(-2.0 MPa)处理小麦根际，诱导小麦叶片产生分子量为18.3~19.8kD的新多肽。Dasgupta等(1984)对6 d龄大麦幼苗黄化转绿期叶子施加-1.0 MPa胁迫，不同部位叶段均产生60kD蛋白。Lopez等(1994)以盐胁迫及水分胁迫小萝卜(Raphanus sativus)叶片，诱导产生22kD多肽。通过SDS-PAGE和IEF/SDS-PAGE两种方法对白桦幼苗叶片蛋白质组分的分析结果表明(图 1、2)，一些低分子量如46.9~10.3kD的多肽变化较大，而大分子量如大于46.9kD的多肽相对稳定。从SDS-PAGE图谱上看到，干旱诱导产生了一条29kD的多肽，经IEF/SDS-PAGE进一步分析发现，分子量为29kD的有2个蛋白质点(图 2，框5)。同时还诱导出14kD pI 5.3、11.5kD pI5.16等蛋白质点(图 2，框6)，并发现一些蛋白质点消失，如12.4~11.5kD pI5.8~6.44之间消失了4个蛋白质点(图 2，框1)。这与前人的报道类似(沈波等，1996；Bray，1988)。可见水分胁迫所产生的蛋白质，虽然因物种及实验方法的不同而异，但变化较大的蛋白质均属小分子量的蛋白。由此可以推测本实验所发现的这些小分子量的蛋白质与白桦幼苗在干旱胁迫下的生理生化代谢更为密切，对其诱导合成的影响更为直接。作为基因的直接表达产物，由蛋白质的变化可以推测基因表达过程中的一些变化。干旱胁迫下，发生变化的蛋白质中，有的消失，有的新出现，而有的蛋白质点颜色加深或变浅。这意味着白桦幼苗的基因表达在干旱胁迫下发生了变化。干旱诱导了一些适应水分胁迫的相关基因启动表达，也使一些基因的表达增强，导致一些新蛋白质的出现和某些蛋白质量的增加。同时一些胁迫前正常表达的基因表达受阻或表达减弱，致使一些原有的蛋白消失或减少。在逆境蛋白的研究中，许多在逆境下出现的蛋白质其功能尚待阐明，哪些逆境蛋白和抗性有关，哪些和伤害反应有关，区分这两者具有重要的意义，对上述出现变化的各蛋白质的特性及生理生化功能，还需做进一步研究。