关于松枯梢病的侵染规律已有很多报道。一般认为松枯梢病菌是一种弱致病菌，可由气孔侵入针叶(Brookhouser, 1971)或直接侵入正在伸长的嫩梢(Chou, 1978)，也可由伤口侵入。入侵菌丝快速扩展，很快产生溃疡、流脂等症状。但也有报道外表健康经表面灭菌的梢头和针叶上可以分离到松枯梢病菌(魏初奖等，1997；沈伯葵等，1993；Stanosz, 1996)，外表健康的松苗栽种到周围无枯梢病发生的林地上可发生枯梢病(魏初奖等，1997；Stannosz, 1997)，表明松枯梢病菌侵染到寄主上后，可能以某种方式潜伏在寄主表面，不立即表现症状。Stanosz等通过对Pinus resinosz和P.banksiana的幼苗和林地里的表面健康梢的研究，首次提出松枯梢病菌在表面健康的梢上存在潜伏侵染，潜伏侵染部位为当年生梢、2 a生梢和2 a生叶(Stannosz, 1997)。国内没有关于松枯梢病菌潜伏侵染的研究，仅有报道国槐溃疡病、杉木炭疽病等存在潜伏侵染(沈伯葵等，1985；邓德胜，1988)。本文旨在在前人研究的基础上，通过组织分离试验和套袋隔离试验等，研究确定松枯梢病菌在我国火炬松(Pinus taeda)、湿地松(P.elliottii)、短叶松(P.echinata)和马尾松(P.massoniana)等松树上是否存在潜伏侵染。

1 材料与方法 1.1 标准地、标准株的确定

1999年1月对江苏省林科院的实验林进行松树枯梢病感病情况的调查，调查株的分级标准及标准地感病指数计算按沈伯葵法(1992)，选择中等发病的火炬松、湿地松、短叶松和马尾松林地作为标准地，并从中各选取感病级数为Ⅱ~Ⅲ的10株单株作为标准株。

1.2 分离培养试验

将40株标准株每月各采1次样，历时1 a。样品按松种用塑料袋单独包好。4℃冰箱保存，将份样按芽、新梢、枝、叶分类(4月前无新梢)，芽去芽鳞(短叶松为带鳞芽)，梢不带木质部，各切成直径3~8 mm大小的组织块，用PDA进行常规组织分离(方中达，1979)；或将表面灭菌后的组织块用百草枯(浓度：6 000 μg·mL^-1)处理45~60 s后，置潮湿滤纸上培养(Sinclair, 1991)。培养后的菌落按沈伯葵法(1992)进行松枯梢病菌的鉴定。

1999年3月，将2 a生湿地松苗定植在中等发病火炬松成林下，从4月起，每月调查1次松苗的发病情况，同时采20个健康梢。将芽和新梢分别切取直径38 mm的组织块，按前述方法进行组织分离。

1.3 套袋隔离试验

1999年3月上旬，当年分生孢子释放前，选取感病级数为Ⅱ~Ⅲ级的火炬松4株，湿地松、马尾松各两株，每株套袋10个健康梢，另取10个健康梢不套袋作对照。6月上旬解袋，同时调查当年春梢感病情况。

2 结果与分析 2.1 标准地感病情况的调查

1999年1月在江苏省林科院一片16 a生成林中对火炬松、湿地松、短叶松、马尾松进行松枯梢病感病情况的调查，发现以上4种松树林地为相邻分布，都有松枯梢病发生，其中湿地松发病较重，感病指数为62.7；火炬松、短叶松为中等发病，感病指数分别为42.1和33.7；马尾松发病较轻，感病指数为12.3。由此确定以火炬松为主要研究对象。在上述4松种中各选择感病级数为Ⅱ~Ⅲ级的10株单株作为标准株。

2.2 松树健康组织中松枯梢病菌组织分离结果

将所采梢头按前述方法进行常规组织分离后，检查组织块长出的菌落，发现主要有以下几种真菌出现：a.组织块上先产生少量稀疏菌丝，迅速扩展，3 d后即产生大量白色绒毛状气生菌丝，5 d后菌落产生灰绿色色素，菌丝成束，放射状分布，将灭菌松针放在菌落上，光暗交替培养两周后，松针上产生大量黑色、半埋生颗粒状分生孢子器、分生孢子较大，暗色，长椭圆形单细胞，少数细胞间有一个分隔，鉴定为松枯梢病菌(Sphaeropsis sapinea)。b.菌丝细密，生长迅速，两天后菌落呈圆形，墨绿色，产生大量粉末状分生孢子，分生孢子椭圆形或棍棒状，暗色，有纵横分隔，鉴定为交链孢菌(Alternaria sp.)。c.菌落白色，背面稍发黄，孢子堆胶漆状，分生孢子有色，梭形，被4个横隔分为5胞，中间3胞有色，顶生3根附属物，鉴定为多毛孢菌(Pestalotia sp.)。此外还有几种不易产生孢子的丝孢菌等。分离到的真菌中，松枯梢病菌和交链孢的得菌率较高，基本上每次分离都有出现，为优势菌种，多毛孢及其它真菌得菌率较低。已知交链孢菌是广泛存在的腐生菌，多毛孢属的某些种可使松树针叶发生赤枯病，不会使松梢发病。将松枯梢病菌与其它真菌在同一个培养皿内培养，结果表明其它出现的真菌对松枯梢病菌没有明显的拮抗作用。在下面的研究中，只统计松枯梢病菌的得菌率。

从1999年1—12月共采12次样，常规分离结果表明：在火炬松、湿地松、马尾松和短叶松上，每次都能从健康的组织中分离到松枯梢病菌，表明该菌除能在病梢、病针叶上存在外，还可在健康梢上存在。按月统计梢(包括芽、新梢、枝、叶)的得菌率。火炬松12次分离，梢的得菌率为15%~37.7%，且大多数月份得菌率高于20%。湿地松梢的得菌率稍低于火炬松，为7.5%~29.1%，得菌率也多高于20%。短叶松梢的得菌率的范围是13.8%~57.1%，各个月之间的差异较大。马尾松梢的得菌率最低，为9.7%~22.4%，多数分离得菌率低于20%。以上数据表明松枯梢病菌在火炬松、湿地松、短叶松的健康梢上都有较多存在，马尾松发病程度低，健康梢上存在的松枯梢病菌也少。

按分离部位分别统计芽、新梢、枝、叶的平均得菌率，火炬松、湿地松、马尾松都是枝 > 新梢 > 芽 > 叶，短叶松的平均得菌率是新梢 > 枝 > 芽 > 叶(图 1)。表明松枯梢病菌在健康梢上的存在数量与梢的生长时间和部位都有关，枝可能由于生长时间长，部分周皮细胞和皮层细胞死亡，松枯梢病菌的侵染机会多，得菌率最高，叶的得菌率最低，则说明松枯梢病菌不易侵入健康针叶。

分析4种松树梢的不同部位在一年中的得菌率变化，发现火炬松枝、芽的得菌率都在4月、7月有2个高峰，3、5、6、8月较低，10月转入休眠生长时，得菌率又回升，新梢4月中旬抽出后，5月就达到50%的得菌率，6月得菌率降低后，7月又逐渐回升，10月至12月松树进入休眠期时，与枝的得菌率基本持平(图 2)。

湿地松的分离情况与火炬松类似，芽在4—5月和7—8月有较高得菌率，新梢4月抽出后，5月松枯梢病菌的得菌率即为41%，6月得菌率降为10%，7月又逐渐回升，10—11月的得菌率较高，枝的得菌率在4月和9月较高(图 3)。短叶松1—6月芽、梢、枝的得菌率变化不大，7月份突然升高，其中芽的得菌率竟然达到100%，然后趋减，但仍保持较高水平，新梢抽出后，得菌率与上年生梢基本持平(图 4)。短叶松7月芽的得菌率大幅增高，是由于标准株春梢发病较重，释放孢子量增多，短叶松又为带鳞芽分离，芽鳞间隙可能带有松枯梢病菌菌丝和孢子。马尾松芽和新梢的得菌率全年维持在较低的水平，4—5月和7—8月的得菌率稍高于其它月份，枝的得菌率在3月和10—11月较高(图 5)。

综上所述，4种松树在4—5月间都有1次侵染高峰，可能由于4—5月是越冬孢子释放时期，林间孢子量增加，侵染机会增多，7—8月是第2次侵染高峰，则是由于春梢感病后产生的分生孢子释放造成的，11月进入休眠期后，4种松树都保持较高的得菌率，表明在不适于松枯梢病菌生长的冬季，健康梢上的松枯梢病菌仍具有较强的生活力。

1999年3月12日将200株湿地松2 a生苗定植于有松枯梢病发生的火炬松成林下，栽苗前随机取20株苗分离芽和梢，未发现松枯梢病菌。从4月起每月调查1次松苗的发病情况，发现松苗4月中旬即有苗木感染发病，发病率达1.8%，5月20日调查发现松苗发病率大幅度上升，有20.5%的梢头表现芽坏死或新梢溃疡，还有少量松苗整株枯死。将病梢去除后，6，7，8，9月每月都有较多的发病梢出现，但发病率逐渐降低，到10月以后，松苗进入休眠期，几乎不发病。表明5~9月是松苗的易感病期。在统计松苗发病情况的同时，每月随机采20个健康梢进行常规分离，统计松枯梢病菌得菌情况，发现从4月起，就能从表面健康的芽上分离到松枯梢病菌，5月起，新梢一长出就能分离到松枯梢病菌，且得菌率达到27.5%，5月以后芽和梢都保持了较高的得菌率。将松苗表面健康梢的得菌情况用曲线图表示(图 6)，发现松苗芽的得菌率在4~8月呈上升趋势，8月的得菌率高达59.1%，8月后芽的得菌率开始降低，但直到进入休眠期，芽上仍具有30%左右的得菌率。梢上的得菌率在5~9月基本维持在20%~30%之间，11月进入休眠期后，得菌率达到50%以上。

2.3 松树健康组织中松枯梢病菌滤纸培养法分离结果

Sinclair(1991)在研究大豆上病原菌的潜伏侵染现象时，发现干燥除草剂百草枯能诱导表面灭菌后的无症状组织产生症状和子实体。这种方法随后被用于鉴定多种寄主上病原菌的潜伏侵染。本试验将表面灭菌的健康芽和梢用百草枯(6 000 μg·mL^-1)浸泡40~45 s后在放有潮湿滤纸的培养皿内光照培养，3 d后即可发现在有的组织块上有白色稀疏菌丝长出，并向周围扩展，6 d后菌丝变为灰绿色，14 d后发现在这些组织块上及周围形成黑色颗粒状分生孢子器，经鉴定为松枯梢病菌。将芽和芽鳞在同一个培养皿内培养，发现产生松枯梢病菌的去磷芽其芽鳞上并没有松枯梢病菌产生，说明松枯梢病菌可潜伏侵染在有芽鳞包裹的健康芽内，而芽鳞则不是松枯梢病菌潜伏侵染的部位。

将1999年11—12月及2000年3月所采的4种松树的休眠期健康梢分成芽和梢，按上述方法进行分离培养，并统计松枯梢病菌的得菌率(表 1)。发现在潮湿滤纸上，所分离的组织块也表现有较高的松枯梢病菌得菌率，得菌情况与常规分离相近，即火炬松、短叶松得菌率高，马尾松的得菌率低，同一松种中，梢的得菌率高于芽。这进一步确定了在健康梢上存在松枯梢病菌的潜伏侵染，并可在其中越冬。这种方法与常规分离相比，不需培养基，真菌易产孢，且表现更直观，是一种研究松枯梢病菌及其他病害潜伏侵染的好方法，可推广到对其它真菌潜伏侵染的研究和内生菌的研究。

2.4 套袋隔离试验结果

6月上旬检查套袋梢和对照梢，结果表明火炬松40个套袋梢中，30个梢正常，6个梢出现枯梢或枯叶症状，4个梢上芽枯死，对照40个梢中，26个梢正常，14个梢出现症状。湿地松20个套袋梢有5个发病，对照梢则有18个发病。马尾松20个套袋梢，有3个梢芽枯死，其余正常，对照梢全不发病。由此可知隔绝当年孢子后，3种松树都有发病梢，表现为芽腐和枯梢两种症状，其中以火炬松发病率最高。对照梢中，则是湿地松发病率最高。总的说来，套袋梢的得菌率低于对照梢(表 2)。

在套袋树及其相邻树木上，用高枝剪随机剪取大枝条，统计当年春梢发病情况，结果表明湿地松发病较重，火炬松发病中等，马尾松发病较轻，与对照梢的发病情况类似。隔绝了当年孢子传播手，套袋梢也有梢发病，说明在发病的春梢中，有一部分是由于在外表健康的芽中潜伏侵染的松枯梢病菌造成的。

3 结论和讨论

松枯梢病菌是一种弱寄生真菌，所导致的松树枯梢病是一种寄主主导病害，其发病主要与树种、松树生长状况，立地条件和降雨量等有关。研究表明在引进国外松之前，马尾松上就存在松树枯梢病菌，但一般发病很轻，在湿地松、火炬松的原产地美国，松枯梢病一般也不产生。引种后，由于在一些地区生长环境不适应，才大面积发生松枯梢病。

本研究表明，在母岩为砂岩，土壤质地为黄沙土的土壤上，国外松的16 a生成林中松枯梢病普遍发生，其中湿地松发病较重，火炬松和短叶松发病中等，而相邻的马尾松则发病较轻，说明感病性与树种有关。通过对火炬松、湿地松、短叶松、马尾松的健康梢逐月进行分离培养，发现在中度感病的林分内，表面健康的梢上普遍存在松枯梢病菌。带菌部位可以是芽、新梢、枝和叶，其中以芽、新梢、枝为主，偶尔在叶上也可分离到松枯梢病菌。在中度感病的林分中，其在短叶松、火炬松和湿地松枝上的带菌率一般为20%~60%，在新梢上的带菌率为10%~50%，在芽上的带菌率为5%~40%，在叶上则一般仅在生长季节有0~10%的带菌率。从总体来看，潜伏带菌率在1年中有2个高峰，即每年的4—5月份和7—8月份各有1个高峰，这可能与当时是松枯梢病菌分生孢子传播盛期有关，10月份以后松树进入休眠期后，仍可维持较高的带菌率，说明在不适于松树枯梢病发生的季节，健康梢上的松枯梢病菌仍具有较强的生活力。

将不带松枯梢病菌的健康2 a生湿地松苗种植在火炬松标准地内，可发生松枯梢病，证明湿地松苗期即可感病。发病高峰期在5—6月，7月后发病逐渐减少，但表面健康芽和新梢的带菌率则逐渐增加，表明松枯梢病菌除了在松苗易感病期导致寄主发病外，还能在松苗的表面健康的梢上发生潜伏侵染，7—8月和10月是潜伏侵染高发期，这与对16 a生健康梢的分离结果是一致的。外表健康的松苗可潜伏带病菌，解释了无病松苗移栽到原先无松枯梢病发生的林地内会发病的现象，也说明不能在有松枯梢病发生的林地附近育苗，以防止苗木带菌后远距离传播枯梢病。

在当年孢子大量传播之前，对火炬松、湿地松、马尾松的健康梢进行套袋处理，隔绝当年外界孢子，仍会在春梢上发生枯梢、芽腐等症状。说明表面健康的梢上可能存在松枯梢病菌并可越冬，它们可造成来年春梢发病。

综上所述，松枯梢病菌在表面健康的火炬松、湿地松、短叶松和马尾松的芽、新梢和枝上都存在潜伏侵染，其中火炬松和短叶松的潜伏率较高，湿地松发病虽重，潜伏侵染率却较低，马尾松带菌最少。芽上潜伏的真菌越冬后可造成松树产生芽腐、枯梢等症状。在新梢和枝上枯梢病菌带菌率较高，而新梢在叶长到1/3长度以上时就不易发生明显病害，梢和枝上潜伏侵染的松枯梢病菌对松树生长是否有影响有待于进一步研究。

由于松枯梢病菌具有潜伏侵染的特性，只有在寄主和环境条件适宜的情况下才发病，如果松树生长良好，既使林间存在松枯梢病菌，也不会造成很大危害。所以防治松枯梢病菌应注意适地适树，在湿地松、火炬松生长不良的地方不宜大量引种；已种植的应加强森林抚育，使松树生长良好，增强抗病性；已发病的林分可注意选择抗病单株，进行抗性育种，或在侵染高峰期进行化学防治。