林业科学  2003, Vol. 39 Issue (3): 153-156   PDF    
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赵锦, 刘孟军.
Zhao Jin, Liu Mengjun.
赞皇大枣优良品系及赞新大枣的RAPD分析
RAPD ANALYSIS ON THE OUTSTANDING CLONES OF ZANHUANGDAZAO AND ZANXINDAZAO
林业科学, 2003, 39(3): 153-156.
Scientia Silvae Sinicae, 2003, 39(3): 153-156.

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收稿日期:2001-12-20

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赵锦
刘孟军

赞皇大枣优良品系及赞新大枣的RAPD分析
赵锦, 刘孟军     
河北农业大学中国枣研究中心 保定 071001
关键词: 赞皇大枣    赞新大枣    优良品系    RAPD    
RAPD ANALYSIS ON THE OUTSTANDING CLONES OF ZANHUANGDAZAO AND ZANXINDAZAO
Zhao Jin, Liu Mengjun     
Research Center of Chinese Jujube, Hebei Agricultural University Baoding 071001
Abstract: 12 outstanding clones of Zanhuangdazao and Zanxindazao were studied using RAPD (random amplified polymorphic DNA) technique. This study aimed at finding out the molecular fingerprints of some related cultivars and clones. 16 10-mer primers selected from 80 ones were used for RAPD analysis. Of the total 70 bands amplified, 19 (27.14%) were polymorphic. RAPD fingerprints of 10 outstanding clones of Zanhuangdazao and Zanxindazao were established using 5 primers and 6 bands (OPE11~1 300 bp、OPG6~3 000 bp、OPF16~840 bp、OPA5~300 bp、OPA5~370 bp、OPE2~1030 bp). The dendrograms of cluster analy sis for Zanhuangdazao clones and Zanxindazao were also established by AVERAGE and SINGLE methods. At the same time, the RAPD analysis on related clones and varieties evolution was discussed accordingly.
Key words: Zanhuangdazao    Zanxindazao    Clones    RAPD    

赞皇大枣是枣树(Ziziphus jujuba Mill.)中目前已知的唯一自然三倍体品种,其果实营养丰富,加工、鲜食均可,是上等的滋补佳品。赞皇县经过多年的栽培选育,筛选出一系列赞皇大枣优良品系。赞新大枣为1975年新疆阿拉尔农科所从引入的赞皇大枣苗中选出的一优良株系,在当地表现良好,被广泛栽植,并命名为赞新大枣(曲泽洲等, 1993)。它和赞皇大枣起源相同,故亲缘关系较近。目前,枣的品种分类大多以形态、用途和分布特征等为依据(俞德浚,1979陈艺林等,1982曲泽洲等,1990陈贻金,1991),容易受到环境条件和人为因素影响,尤其在品系和一些近缘品种的种质鉴定上由于缺乏科学、准确的检测系统,导致同物异名、同名异物现象比较严重,给生产、科研中种质交流带来困难。本研究拟利用RAPD技术,对赞皇大枣优良品系及其近缘品种赞新大枣进行RAPD指纹检测和亲缘关系分析,以期为这些优良种质的交流和科学利用提供参考,同时也为RAPD技术在品系鉴定中的应用提供依据。

1 材料与方法 1.1 材料

本试验所用试材,赞皇大枣优良品系采自河北赞皇县林业局示范园,赞新大枣采自山西果树研究所国家种质资源圃。见表 1

表 1 供试赞皇大枣优良品系及赞新大枣 Tab.1 Outstanding clones of Zanhuangdazao and Zanxindazao tested in this study
1.2 DNA提取和RAPD反应

选择健康的植株(枝条),摘取幼嫩叶片或茎尖,先用自来水清洗干净,再用蒸馏水洗2遍,吸水纸吸干后放入-70℃冰箱,保存待用。

本试验应用改良的CTAB法提取基因组DNA,各缓冲液配制均按《分子克隆实验指南》(1992)进行。RAPD反应在美国MJ Research公司96V Block型PTC-100热循环仪上进行。通过对Operon和Sangon公司80多个随机引物的筛选,16个多态性高的引物用于正式扩增。反应采用25 μL体系:25 mmol MgCl2,2 μL;10×PCR缓冲液,2.5 μL;10 ng·μL-1引物,1.5 μL;20 ng·μL-1DNA,1.5 μL;2 mmol dNTP,2 μL;5 U·μL-1Taq DNA聚合酶,0.3 μL;ddH2O(双蒸水),15.2 μL。加入18 μL矿物油覆盖,按如下程序进行扩增:94℃,4 min;94℃ 30 s,36℃ 40 s,72℃ 1 min,50 cycles;72℃,8 min。

RAPD扩增产物用1%琼脂糖凝胶(含0.5 μg·mL-1EB)电泳分离,电泳缓冲液为0.5×TBE,电泳结果在紫外透射仪上观察、照相。每个引物的扩增产物选稳定而清晰的条带进行统计。RAPD条带“有”记为“1”,“无”记为“0”。最后将多态性统计数据输入计算机,在SAS软件下应用类平均法(AVERAGE)和最短距离法(SINGLE)进行系统聚类分析,建立树状图。

2 结果与分析 2.1 赞皇大枣优良品系及赞新大枣的RAPD扩增结果

本试验应用16个引物进行了12个赞皇大枣优良品系及赞新大枣的RAPD分析,共扩增出70条DNA带,其中多态性带数为19条,占总数的27.14%,扩增出的带大小在300~3 000 bp之间。由S154引物得到的RAPD产物图谱如图 1

图 1 S154引物扩增的赞皇大枣品系和赞新大枣的RAPD图谱 Fig. 1 The RAPD patterns of Zanhuangdazao and Zanxindazao amplified with primer S154
2.2 赞皇大枣优良品系及赞新大枣的RAPD指纹

12个赞皇大枣优良品系属于近缘品系,有些品系的外部形态非常相似不易区分。通过RAPD分析,虽然1号和2号样品没有分开,但另外的大部分品系均被区分开了。可见,在引物数量足够的情况下,RAPD可以进行枣近缘品系间的指纹鉴定。为提高工作效率,在本试验范围内我们尝试用最少的引物将所有品系全部分开。结果(如表 2所示)仅用5个引物6条DNA带就可以将其全部区分开(除赞皇1号、赞皇8号外)。同时,为了用最少的标记将各品系鉴定出来,我们对原始数据进行了统计分析,得出了各品系的RAPD标记或标记组合,从表 3可以看出,用1~4个RAPD标记可以将各品系鉴定出来。

表 2 12个赞皇大枣优良品系及赞新大枣的RAPD指纹 Tab.2 The specific RAPD fingerprints of Z. jujube cv. Zanhuangdazao clones and Z. jujube cv. Zanxindazao
表 3 12个赞皇大枣优良品系及赞新大枣的特征性RAPD标记 Tab.3 The specific RAPD markers of Z. jujube cv. Zanhuangdazao clones and Z. jujube cv. Zanxindazao
2.3 赞皇大枣优良品系及赞新大枣的聚类结果

类平均法聚类结果见图 2,对树状图截集λ(被合并的2类之中观测值之间的距离平方根)=4时,供试样品分为5类:Ⅰ(赞皇5、6、9、11号)、Ⅱ(赞皇3、10号)、Ⅲ(赞皇2、4、7、12号)、Ⅳ(赞皇1、8号)、Ⅴ(赞新大枣)。

图 2 赞皇大枣品系和赞新大枣的类平均法聚类树状图 Fig. 2 Dendrogram of cluster analysis for Zanhuangdazao clones and Zanxindazao(AVERAGE)

最短距离法聚类结果见图 3,对树状图截集λ(类间最短距离)=3.4时,供试样品分为5类:Ⅰ(赞皇3、5、6、10、11号)、Ⅱ(赞皇9号)、Ⅲ(赞皇2、4、7、12号)、Ⅳ(赞皇1、8号)、Ⅴ(赞新大枣)。

图 3 赞皇大枣品系和赞新大枣的最短距离法聚类树状图 Fig. 3 Dendrogram of cluster analysis for Zanhuangdazao clones and Zanxindazao(SINGLE)

从以上结果可以看出,两种方法的聚类结果基本一致,Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ类完全一样,只是在Ⅰ和Ⅱ类之间稍有变动。其中,赞新大枣总是最后与赞皇大枣各个品系聚在一起,说明它与赞皇大枣各个品系之间的亲缘关系比赞皇大枣品系内部的都要远一些。

3 讨论

多数人曾怀疑过RAPD技术对品系进行分析鉴定的可行性。直到近几年,人们才应用RAPD技术对菌类及部分植物进行品系的分析鉴定,并取得了良好效果(苏晓华等,1995王三红等,2000翁尧富等,2001张东晓等,2000赵虎基等,1999祝军等,2000Corwhurst et al., 1991Castigliones et al., 1993)。刘孟军(1995)彭建营等(2000)曾对枣和酸枣的一些品种进行过RAPD分析,但应用此技术对枣品系进行分析鉴定尚未见相关报道。本试验仅用5个引物就可将赞皇大枣的12个近缘优良品系绝大部分分开,并且获得了一些品种的特征性RAPD标记。从不同引物的鉴定效率分析,扩大引物筛选范围,可望获得更高效率的引物和全部供试品种、品系的特征性分子标记。据此,RAPD技术应用在品种、品系的分析鉴定中是完全可行的,可以很好的反映各品种、品系的亲缘关系,尤其在一些近缘品种、品系的分析鉴定中具有良好的应用前景。

从本试验结果还可看出,赞新大枣和赞皇大枣各个品系间的差异都比赞皇大枣品系内部的差异要大。虽然从起源上,赞新大枣来源于赞皇大枣,但地域的差异、气候条件的变化,使它的各个方面,甚至在DNA水平上都发生了较大的变异。所以,赞皇大枣引种到新疆后命名为另一品种——赞新大枣,还是有一定依据的,这应该是品种演进的结果。通过同一物种在不同地区的栽培、选育和驯化,往往可以演进出一些新类型或新品种。

参考文献(References)
陈艺林, 周邦楷. 1982. 中国植物学志. 第48卷(第一分册). 北京: 科学出版社, 113-146.
陈贻金. 1991. 中国枣树学概论. 北京: 中国科学技术出版社, 1-7.
刘孟军. 1995. RAPD技术在枣和酸枣种质鉴定中的应用研究.中国科协第二届青年学术年会园艺学论文集. 北京: 北京农业出版社, 337-341.
J.萨姆布鲁克, E.F.费里奇, T.曼尼阿蒂斯.分子克隆实验指南.金冬雁, 黎孟枫等译.北京: 科学出版社, 1992
彭建营, 束怀瑞, 孙仲序. 2000. 中国枣种质资源的RAPD分析. 园艺学报, 27(3): 171-176. DOI:10.3321/j.issn:0513-353X.2000.03.004
曲泽洲, 王永惠主编.中国果树志·枣卷.北京: 中国林业出版社, 1993: 22
曲泽洲, 孙立尉. 1990. 果树种类学. 北京: 农业出版社, 232-243.
苏晓华, Zsuffa L, Lin D. 1995. 用RAPD技术估测柳树种及无性系的变异. 林业科学, 31(3): 211-214.
王三红, 陈力耕, 章镇. 2000. RAPD在柑桔品系鉴定上的应用. 果树科学, 17(1): 70-72. DOI:10.3969/j.issn.1009-9980.2000.01.015
翁尧富, 陈源, 赵勇春. 2001. 板栗优良品种(无性系)苗木分子标记鉴别研究. 林业科学, 37(2): 51-55. DOI:10.3321/j.issn:1001-7488.2001.02.007
俞德浚. 1979. 中国果树分类学. 北京: 农业出版社.
张东晓, 糠谷明. 2000. RAPD分析用于厚皮甜瓜若干品种或品系间的比较. 福建农业大学学报, 29(4): 435-439.
赵虎基, 乐锦华. 1999. 籽用西瓜品种(系)间亲缘关系的RAPD分析. 果树科学, 16(3): 235-238. DOI:10.3969/j.issn.1009-9980.1999.03.016
祝军, 周爱琴, 夏国海. 2000. 果树品种(品系)鉴定技术研究进展. 河南农业大学学报, 34(4): 371-375. DOI:10.3969/j.issn.1000-2340.2000.04.017
Castigliones S, et al. 1993. Identification of elite poplar (Populus spp.) clones using RAPD fingerprint. Theror App Genet.
Corwhurst R N, et al. 1991. Differentiation of Fusarium solani f.sp. cucurbitae races 1 and 2 by random amplification of polymorphic DNA. Current Genetics, 20: 391-396. DOI:10.1007/BF00317067