昆虫被寄生蜂寄生后有关生理生化方面的变化研究报道颇多，主要集中在寄生蜂蜂毒对寄主的作用(Beckage, 1987; David et al., 1994)、寄生蜂和寄主在激素水平的相互关系(Thompson, 1985)和寄生蜂对寄主生长发育的调控(Beckage, 1985; Grenier et al., 1986; Lawrence, 1986)、以及被寄生后寄主血淋巴和血细胞免疫机制(杭三保等，1991；陈志辅等，1992-1993)的改变等方面，并且这些研究主要是针对内寄生昆虫进行的，而对于外寄生蜂寄生后寄主机体组织结构及生理生化变化研究报道较少。川硬皮肿腿蜂(Scleroderma sichuanensis Xiao)是在四川发现的一个肿腿蜂新种(周祖基等，1997)，是杉棕天牛(Callidium villosulum Fairmaire)和松墨天牛(Monochamus alternatus Hope)等钻蛀性害虫的优势天敌，但该蜂的自然种群数量小，急需通过离体培养的手段获得大量的寄生蜂以便在生产中大面积推广应用。本研究以替代寄主为川硬皮肿腿蜂的室内中间寄主，对替代寄主被川硬皮肿腿蜂寄生后主要生理生化及组织结构的变化进行了探索，为进一步研究川硬皮肿腿蜂的寄生生理和离体培养提供科学的依据。本文报道了机体蛋白、氨基酸含量及蛋白酶活力变化方面的研究结果。

1 材料与方法 1.1 试验材料 1.1.1 供试寄生蜂

室内繁殖的川硬皮肿腿蜂(S. sichuanensis Xiao)(以下简称川蜂)。

1.1.2 供试寄主

室内繁殖的替代寄主(本替代寄主为一种鞘翅目(Coleoptera)昆虫，现处于技术保密阶段)。

1.2 试验方法 1.2.1 接蜂与培养

替代寄主用2^#处理液(2^#处理液为本实验室自主开发的消毒液)消毒后置于指形管中，然后接种寄生蜂，寄生蜂与寄主比例为2:1，培养的温度条件t：(26.5±0.5)℃、相对湿度RH：70%~85%。

1.2.2 检查与取样

接蜂后，逐日观察记录替代寄主和川蜂的行为、形态变化，据二者在形态和行为方面的变化，划分川蜂寄生替代寄主的阶段进程；取寄生当天(第1 d)和寄生后第10 d的替代寄主进行解剖观察和石蜡切片观察，取寄生当天(第1 d)、寄生后第3 d、6 d、10 d分别进行生化分析，每阶段重复3次，取平均值。

1.2.3 解剖及石蜡切片观察

采用常规解剖法，观察虫体腹部贮存脂肪体组织的存在状态、体液的澄清状况，消化道的完整性及消化道内容物的存在状况，虫体肌肉状况记录并照相；石蜡切片厚度6~9 μm，Ehrilich’s苏木精染色，然后选出合适的纵横切片，观察肌肉组织、消化道、马氏管、气管等的结构变化状况，记录并照相。

1.2.4 蛋白质含量测定

采用Folin-Phenl法(郭郛等，1988；冯慧，1989)。

1.2.5 游离氨基酸的组成和含量测定

采用OPA、FMOC……全自动氨基酸分析法。

样品前处理：测定游离氨基酸的前处理参照(黄复生等，1990；陆温等，1993)的方法进行。

HP 1100-HPLC氨基酸分析的色谱条件：

色谱柱：HP ODS Hypersil 5 μm，12.5mm×4.0 mm；

流动相：A 20 mmol·L^-1 NaAC……水溶液，含0.4%的四氢呋喃及200 mg·L^-1的TFA，pH7.2；

    B 100 mmol·L^-1 NaAC……水溶液，含45%甲醇和35%乙氰，pH7.2；

流速：1.0 mL·min^-1；

柱温：30℃；

进样量：2 μL；

检测器：UV-DAD，λ=338 nm，262 nm。

1.2.6 蛋白酶的提取及活力测定

酶液的制备：取替代寄主1 g，加1 mL 0.05 mol·L^-1 pH8.3的Tris-HCl缓冲液在冰浴中匀浆，用2 mL缓冲液洗匀浆器2次，然后一并转入离心管，4℃，7 600 rpm离心20 min。取上清液，加入3倍体积的预冷丙酮，边加边搅拌，4℃，4 000 rpm离心20 min，取沉淀，溶于5 mL 0.05 mol·L^-1 pH8.0的Tris-HCl缓冲液中，即为粗酶制剂，置于0℃的冰箱中保存备用。

酶活力测定：Folin-phenl试剂法(郭郛等，1988)

酶活力计算利用下述公式进行：

式中，X:蛋白酶比活力；g：标准曲线查得值；V₁：粗酶液体积；V₂：反应液体积；M：样品干重；T：反应时间；d：稀释倍数。

2 结果与分析 2.1 替代寄主的组织结构变化

解剖观察表明：替代寄主被川蜂寄生的当天到第10 d，其脂肪体组织、肌肉组织、消化道、马氏管、气管等组织系统发生了明显的病理变化。寄生当天，虫体内脂肪组织完整，条带状浸浴于澄清的体液中，马氏管健康完好，能观察到有节律地收缩(图版Ⅰ-1)；消化道完整，其内体液清澈透明(图版Ⅰ-3)；肌肉组织呈乳白色半透明，外被膜完整，肌肉之间及肌肉与外骨骼之间连接完整而致密；气管呈白色，完好(图版Ⅰ-5)。寄生后第10 d，虫体内脂肪组织完全解体，体液呈稠乳浊状充满整个体腔，马氏管遭到一定程度的破坏，观察不到有节律的收缩(图版Ⅰ-2)；消化道亦遭到很大程度破坏，其中体液亦呈乳浊状(图版Ⅰ -4)；肌肉组织严重解体，呈黄棕色，肌肉组织的外被膜遭到破坏，露出肌肉束，肌肉组织之间的连接削弱，肌肉与骨骼几乎脱离，节间内骨骼外露，气管系统亦解体，呈棕黑色，失去韧性，极易损坏(图版Ⅰ-6)。

组织切片观察结果表明：寄生当天替代寄主肌肉组织(体壁肌)完整，肌肉组织之间及肌肉与内骨骼(悬骨)连接紧密，肌肉组织致密，外膜(表皮)紧贴于其上(图版Ⅰ-7、图版Ⅰ-9)，消化道(中肠)完整，纵肌、环肌、底膜及肠壁细胞紧密排列(图版Ⅱ-1、图版Ⅱ-3)，马氏管和气管结构完整，气管螺旋丝排列紧密(图版Ⅱ-5、图版Ⅱ-7)。寄生后第10 d替代寄主变化明显，肌小腱消失，肌肉组织完全脱离骨骼(悬骨)，肌肉组织之间的连接松散，肌纤维脱落，纤维端部游离在体腔中；肌肉组织开始解体，外表皮(膜)脱落，肌肉组织内部出现大的缝隙(Ⅰ-8、Ⅰ-10)；消化道(中肠)纵肌环肌开始解体，肠壁细胞层与底膜层完全脱离，无法辨认杯形细胞和柱状细胞(Ⅱ-2、Ⅱ-4)，马氏管壁模糊，管壁细胞开始解体(Ⅱ-6)；气管的管壁细胞层轮廓模糊、内膜收缩、螺旋丝不规则而粗糙，亦趋解体(Ⅱ-8)。

2.2 蛋白质含量的变化

替代寄主被川蜂寄生后，体内蛋白质含量随着寄生过程的发展而逐渐下降(图 1)。寄生后第1~3 d，蛋白质含量略有下降，此时处于替代寄主被川蜂麻醉的时期，川蜂已将蜂毒注入寄主体内，替代寄主的活动能力已渐丧失；寄生后的第3~6 d，蛋白质含量急剧下降，第6 d比第3 d减少46.893 5 mg·g^-1，减少了11.5%，是对照减少量的2倍，此期川蜂麻醉替代寄主后，开始刺探取食，孕育卵的成熟；第6~10 d，蛋白质含量又下降了20.453 3 mg·g^-1(5.66%)，而对照的蛋白质含量基本保持不变。

2.3 游离氨基酸总量及各组份含量的变化 2.3.1 游离氨基酸总量的变化

替代寄主被川蜂寄生后，寄主体内游离氨基酸的总量随着寄生过程的发展而逐渐增加(表 1、图 2)。寄生后第3 d比第1 d略有增加，第6 d迅速升高，比第1 d增加5.326 0 mg·g^-1，增加了33.93%，然后继续上升至第10 d的22.362 7 mg·g^-1，比第1 d增加42.45%，增加了6.664 3 mg·g^-1。而同期对照寄主体内的游离氨基酸含量在第3 d略有下降后保持相对稳定、且绝对含量也比寄生寄主低得多。

寄生寄主体内游离氨基酸总量的变化趋势与蛋白质的变化趋势正好相反。这是因为替代寄主被川蜂寄生后，机体蛋白发生水解而导致游离氨基酸含量增加，蛋白质含量减少。

2.3.2 游离氨基酸各组分含量的变化

替代寄主被川蜂寄生后，寄主体内共检测出17种氨基酸，而未检出胱氨酸和半胱氨酸(表 1)。在所检测出的17种氨基酸中，Ser、Gly、Ala、Val、Met、Phe、Ile、Leu、Lys、Trp等10种氨基酸的绝对含量变化趋势与游离氨基酸的总量的变化一致，即均随着寄生的推进其含量逐渐增加，寄生后第10 d川蜂卵孵化，幼虫开始取食时达最大值，寄生后第10 d与第1 d相比，增加最多的是Ala，增加3.042 2 mg·g^-1，增幅为300.26%，其余依次为Met(0.432 2 mg·g^-1，187.59%)，Gly(0.699 2 mg·g^-1，139.26%)，Leu(1.043 9 mg·g^-1，126.21%)，Ile(0.513 5 mg·g^-1，105.99%)，Lys(0.707 0 mg·g^-1，95.64%)，Phe(0.393 0 mg·g^-1，90.97%)，Val(0.806 0 mg·g^-1，68.92%)，Ser(0.387 0 mg·g^-1，63.13%)，Trp(0.150 0 mg·g^-1，24.89%)；而同期对照相应氨基酸组份的含量则逐渐减少或趋于相对稳定(图 3、4、5)。Glu、Arg两种游离氨基酸的含量却随寄生的推进而逐渐降低，与同期对照相应组份的变化趋势一致(图 6)；Tyr、Pro则呈抛物线变化(图 7)，均在被寄生后的第6 d达最大值分别为2.609 9 mg·g^-1和1.887 3 mg·g^-1，分别比第1 d增加13.51%和28.18%，第6~10 d迅速减少，至第10 d达最小值1.910 2 mg·g^-1和1.251 0 mg·g ^-1，比第6 d分别下降了19.45%和33.71%。而对照Tyr含量则几乎相反，第3 d达最低值，第10 d又回到与第1 d相当的水平；对照Pro几乎呈直线下降，第10 d达最低值；Asp和His的变化与Tyr和Pro比较类似。Thr的含量呈先减后增的下抛物线变化，在寄生的第1 0 d达最大值0.674 1 mg·g^-1，相应对照游离Thr的含量几乎保持水平直线而没有多大变化(图 7)。

游离氨基酸各组份的含量(见表 1)在不同的寄生时期差异较大，其中最主要的有6种，分别为Ala、Arg、Tyr、Val、Leu、Pro，它们的含量之和占总游离氨基酸的比例在54.05%~60.73%之间，替代寄主被寄生的第1、3、6、10 d分别为54.05%、55.75%、60.73%、56.91%(对应的绝对含量分别为8.483 5 mg·g^-1、9.767 4 mg·g^-1、12.768 1 mg·g^-1、12.726 6 mg·g^-1)，对照6种氨基酸含量之和的变化趋势与其相反。在所检测出的17种游离氨基酸中，各寄生时期含量最高者除寄生后第1 d为Tyr外，第3、6、10 d均为Ala，其含量分别为14.65%、13.04%、18.36%、19.47%，Ala的变化尤为突出，而对照在各个时期含量最高者均为Tyr，分别为15.08%、11.41%、14.65%、20.10%。替代寄主被川蜂寄生后第10 d，川蜂幼虫已经孵化出来并开始取食，此时寄主体内游离氨基酸的组成比例无疑对于确定川蜂幼虫的离体氨基酸营养需求具有重要的参考价值。

2.4 蛋白水解酶活力的变化

替代寄主被川蜂寄生后，寄主机体组织蛋白水解酶活力发生了很大的变化(图 8)。被寄生后的第1~3d，蛋白水解酶活力迅速升高，第3 d达最大值634.786 4 μg·g^-1min^-1，是被寄生当天酶活力的1.75倍，此时川蜂已利用蜂毒将替代寄主完全麻醉，并开始取食体液，孕育卵的成熟；寄生后的3~6 d，蛋白水解酶活力较大幅度降低，比第3 d降低了181.134 6 μg·g^-1min^-1，但其活力水平仍高于寄生的当天；第6~10 d，酶活继续下降，但幅度较小。对照蛋白酶活力的变化趋势与寄生寄主相似，但对照酶活力高峰出现在第6 d，其峰值大小要比寄生寄主低81.955 2 μg·g ^-1min^-1，很显然，由于川蜂寄生而使替代寄主体组织蛋白酶活力高峰提前且活力提高。

2.5 蛋白质、氨基酸的含量与蛋白水解酶活力变化的关系

替代寄主体内蛋白水解酶活力的迅速增强发生在被川蜂寄生后的第1~3 d，而蛋白质含量的迅速减少和游离氨基酸总量的急剧增加却发生在被寄生后的第3~6 d(图 9)。这表明由于蛋白酶活力的增强而导致蛋白质含量的减少和游离氨基酸总量的增加，并且后者比前者滞后2 d左右出现。

3 讨论 3.1 蛋白质与氨基酸代谢

替代寄主被川蜂寄生后，体内蛋白质和氨基酸的代谢发生了明显的变化。川蜂寄生替代寄主的第1~3 d，寄主体内蛋白水解酶的活力迅速上升，在寄生后的第3 d达到最大值，蛋白水解酶作用于其底物蛋白质，使寄主体内蛋白质发生剧烈水解，被寄生后的3~6 d蛋白质含量急剧下降，第10 d蛋白质含量达到最低点, 这也可以从解剖和石蜡切片观察到的肌肉组织的解体状况得到应证；相应地，蛋白质的水解产物——游离氨基酸的含量迅速上升，在第10 d达到最高值，这与二化螟绒茧蜂寄生二化螟幼虫后第2天血淋巴蛋白总量降低、游离氨基酸总量上升的变化规律很类似(杭三保等，1991)。这一变化发生在替代寄主被川蜂蜂毒麻醉的这段时间内，并且寄生寄主的酶活力高峰比对照寄主提前2~3 d出现，这很可能是由于蜂毒的注入，提前激活了寄主体内的蛋白水解酶系或抑制了蛋白合成酶系的活力。但从本研究的结果可知，被寄生寄主的蛋白酶活力的最大值明显地高于对照的最大值，这表明，也可能由于蜂毒中某种化合物的刺激作用，导致了寄主体内新的水解酶蛋白的合成，但这需要进一步研究证实。

对照寄主蛋白酶活力在第6 d出现一个小高峰，因为此时替代寄主即将羽化，寄主体内正进行着复杂的生理生化变化，蛋白水解酶作用于寄主体原有的结构蛋白，使其水解产生大量的游离氨基酸，为替代寄主的机体重建提供物质基础，为即将进行的变态行为做准备。

3.2 川蜂的氨基酸营养生理

据报道，同翅目昆虫被寄生后，血淋巴组成的变化朝着有利于寄生物的方向进行，并提出这一变化是由于“寄主制御”所引起的。所谓“寄主制御”就是寄主在受到寄生昆虫寄生后，产生的麻痹以及取食、生长发育、生理生化变化朝着有益于寄生昆虫的方向进行的现象(Vinson et al., 1980)。川蜂为一种外寄生蜂，在本试验条件下，其寄主(替代寄主)最多只在被寄生后的第1~6 d保持着生命活力，较内寄生昆虫与寄主共同生活的时间要短得多，但它仍表现出了“寄主制御”现象。寄生后1~3 d水解酶活力的上升而引起蛋白质含量下降、游离氨基酸总量上升，这一系列的变化无论是寄主机体的营养组份或是其物理性状，均朝着有利于川蜂幼虫取食和发育的方向进行。当然，这也是寄生昆虫和寄主长期自然选择、协同进化的结果。

膜翅目寄生蜂幼虫具有高度特化的咀嚼式口器，但基本丧失了咀嚼功能，所以它主要取食可溶性的流体状食物；另外，寄生蜂幼虫的肠道也发生了特化(Ian et al., 1992)，表现为其肛道虽有内陷但没有与中肠相接，因此，肠道在端部就封闭了，幼虫的大部分阶段都呈这种状况，粪便因而积累在中肠端部，直到化蛹前肠道发育完成时才将幼虫期累积的粪便一次性排除。所以，川蜂幼虫要能正常的生长发育，就必须尽可能减少代谢废物的累积，取食组成简单的小分子物质以满足它的需要，如游离氨基酸、葡萄糖、游离脂肪酸、核苷酸等。本试验对寄主体内蛋白质、氨基酸代谢的研究在一定程度上证实了这一点。二化螟绒茧蜂寄生二化螟后主要取食血淋巴中游离氨基酸和糖类化合物的结论也与此十分类似(杭三保等，1991)。

通常认为，昆虫的必需氨基酸有10种，分别是Lys、His、Arg、Trp、Ala、Val、Met、Ile、Leu、Phe(House, 1967)，替代寄主被寄生后第10 d寄主体内游离氨基酸中，必须氨基酸占68.04%，必需氨基酸与非必需氨基酸的比值为2.13，FAO/WHO(粮农组织/世界卫生组织)提出的一般动物参考蛋白模式是饲料必需氨基酸占氨基酸总量的比例为40%左右，必需氨基酸与非必需氨基酸的比值在0.6以上(王达瑞等, 1991)。而昆虫的营养需求又与一般动物很类似，所以替代寄主被寄生后第10 d的游离氨基酸组成能充分地满足川蜂幼虫对氨基酸的需求。另外，Ser、Gly的含量在寄生期间逐渐升高，Ala和Tyr的含量也较高，这可能表明川蜂幼虫在发育过程中对这几种氨基酸的需求量较大。

搞清川蜂幼虫在取食寄主时(本试验为寄生后第10 d)寄主的营养组份是非常重要的，因为这才真实地反应了川蜂的营养需求，这对川蜂幼虫的离体培养的饲料配制是十分重要的。本研究已对蛋白质、氨基酸进行了分析，但主要的糖类、核酸物质、脂肪酸、维生素、无机元素、激素等生化成份还有待进一步研究。