毛白杨(Populus tomentosa)是我国特有的杨属白杨派树种，具有生长迅速、材质优良、树干高大通直等特性，主要分布在我国黄淮海流域约100万km²的范围内。在我国北方，尤其在黄河中下游林业生产和生态环境建设中占有重要地位。在长期的自然演化过程中形成了高度杂合、类型繁多、形态各异、遗传基础相差很大等变异极其丰富的各种类型毛白杨。近年来，分子生物学的DNA标记技术发展迅猛，成为林木遗传育种研究中的有力工具，将其用于毛白杨遗传学领域的研究，通过分析杂合位点在子代群体中的分离可有效研究该树种的平均遗传杂合水平。本文运用重复性好、多态性高的AFLP标记技术，以毛新杨(Populus tomentosa×P. bolleana)无性系LM50的种间回交子代中随机抽取的120株个体为材料，检测和分析了毛白杨及其杂种毛新杨的遗传平均杂合水平。

1 材料和方法 1.1 植物材料

中国林业科学研究院林业研究所徐纬英研究员于1958年以河南郑州毛白杨无性系雌株为母本，新疆杨雄性无性系为父本控制授粉杂交得到若干株毛新杨，定植于前北京农业大学校园内。2000-01，以种植在北京中国农业大学校园的毛新杨无性系雌株TB01为母本，与种植在山东冠县全国毛白杨基因库的毛白杨雄性无性系LM50控制授粉杂交得到694株种间回交子代幼苗。将得到的幼苗按株行距80 cm×110 cm种植于北京林业大学苗圃，并随机抽取120株个体用于遗传杂合水平分析。

1.2 DNA提取

按Murray和Thompson (1980)描述的方法进行。

1.3 AFLP分析

本研究AFLP分析的基本程序和Vos等(1995)发明的方法基本相同，仅对体系进行了优化。对于杨树这样一个小基因组的林木模式树种来说，采用EcoRI/MseI酶切组合进行基因组限制性酶切。预扩增反应选用引物组合EcoRI₊₀₀/MseI₊₀₀，选择性扩增反应采用引物组合EcoRI₊₃/MseI₊₃。PCR扩增反应在PE-9600PCR仪上进行。

1.4 电泳

选择性扩增产物经变性后在6%的变性聚丙烯酰胺序列分析胶上电泳分离，条件是95W，3 000V，恒功率电泳约90 min。电泳后采用Tixier等(1997)描述的银染检测方法进行AFLP指纹显色反应。

1.5 杂合水平分析

平均杂合水平被定义为在子代中分离的总带数与观察的总带数之比(Cervera et al., 2001)。本研究利用30对AFLP引物组合，通过分析毛新杨×毛白杨回交子代120株个体及其亲本的基因型分离情况来估计毛白杨及毛新杨的平均遗传杂合水平。

2 结果与讨论 2.1 引物组合和多态性水平分析

对于缺少遗传研究基础的树种来说，AFLP标记被认为是目前所有已开发的分子标记技术中多态性最高、重复性最好的遗传分析技术(张德强等，2000)。因此，采用该标记技术，利用不同的引物组合，以毛新杨×毛白杨的回交分离群体为材料，可有效地估计毛白杨及其杂种毛新杨的平均遗传杂合水平。在植物中，研究发现用不同限制性内切酶组合如EcoRI/MseI和PstI/MseI等得到的指纹丰富程度和有价值的位点的比例存在显著差异(Vuylsteke et al., 1999)。PstI是甲基化敏感型的限制性内切酶，由于甲基化一般不发生在表达的基因组DNA中，而大多数来自结构基因区(Vuylsteke et al., 1999), 因此相对于大基因组来说，用PstI得到的指纹能满足研究需要，而对于杨树这样一个小基因组的模式树种来说，若用PstI作为限制性内切酶则得到的指纹没有用EcoRI得到的指纹丰富，所以本研究选用了EcoRI/MseI酶切组合来研究毛白杨及其杂种毛新杨的DNA多态性水平。

在AFLP选择性扩增引物组合EcoRI/MseI中，选择性核苷酸的数量和碱基序列是决定每一AFLP扩增反应产生DNA片断丰富程度的关键因素。本研究采用了预扩增引物组合E₀₀/M₀₀，选择性扩增引物组合E₊₃/M₊₃来进行毛白杨和毛新杨的遗传分析研究。从160对AFLP引物组合中筛选了30对在双亲及10个子代中扩增性好、多态性高的引物组合用于毛白杨和毛新杨的平均遗传杂合水平研究。不同的E₊₃/M₊₃引物组合可产生不同数量及大小的AFLP片断(表 1)。从表 1可以看出，30对AFLP引物组合可检测到的片断从50 ~ 110个不等，平均为65.73个；30对AFLP引物组合共检测到536个多态性位点，多态性最高的引物组合，如E₃₄ /M₄₄和E₆₃/M₆₁可检测到26个多态性位点，最少的引物组合，如E₃₃/M₈₆可检测到8个多态性位点，平均每对AFLP引物组合可产生17.87个多态性位点，多态性水平16.0% ~ 40.6%，平均水平为27.4%。

从表 1可看出，每一引物组合可检测到的片断总数与在分离群体亲本毛白杨和毛新杨中具有多态性的片断总数不存在线性相关。在AFLP扩增性反应中，研究发现，若EcoRI和MseI引物的选择性碱基中含有AG或GA，AT或TA，TC或CT时，扩增的谱带较多且多态性较高。据此，可推测在毛白杨和毛新杨基因组中含有较多的AG/GA, AT/TA, TC/CT重复序列，这为开发毛白杨S SR引物提供了重要的线索。Dayanandan等(1998)研究美洲山杨基因组时发现，在美洲山杨基因组中存在丰富的TC/AG重复序列，其研究结果与本研究很相似。这也表明了杨属内不同种之间具有很高的同源性。

2.2 遗传平均杂合水平分析

树木具有世代周期长、个体高大、高度杂合和高的遗传负荷等特性，很难用传统的数量遗传学方法和手段对其遗传结构进行深入的研究。利用已有的分子标记技术分析杂合位点在遗传分离群体中的分离是研究毛白杨遗传杂合度的有效方法。采用30对不同的AFLP引物组合，12 0个杂交子代个体及其亲本来检测分离群体亲本的遗传平均杂合水平。分别统计了来自亲本毛新杨和毛白杨的多态性位点(表 1)。从表 1可看出，不同引物组合能够检测到的来自双亲的多态性位点及其杂合水平有显著的差异。对于来自毛白杨的杂合位点来说，多态性最高的引物组合E₄₄/M₄₆可检测到19个多态性位点，多态性最低的引物组合E₃₃/M₆₂, E₃₃/M₈₂和E₃₃/M₈₆分别检测到6个来自毛白杨的杂合位点。这30个不同的AFLP引物组合能够检测到毛白杨杂合位点百分率即毛白杨杂合水平范围为9.10% ~ 30.19%，平均为18.71%。能够检测到的来自毛新杨的杂合位点最多的引物组合为E₆₃/M₆₁, 可检测到13个多态性位点，检测到位点数最少的引物组合为E₃₃/M₆₅，仅能检测到1个多态性位点。检测到毛新杨最高杂合水平为20.31%(E₆₃/M₆₁), 最低杂合水平为1.39%(E₃₃/M₆₅)，平均杂合水平为8.47%。例如图 1显示了AFLP引物组合E₃₃/M₄₇在分离群体亲本毛白杨和毛新杨中的多态性水平及在部分子代中的分离情况。从能够检测到的分离群体亲本平均杂合水平来看，能够检测到的毛白杨的平均杂合水平是毛新杨的2倍多，这一结果说明了毛白杨是一高度杂合的杨属白杨派树种，在长期的进化过程中，形成了许多高度杂合、变异极其丰富的毛白杨野生类型。研究发现，尽管毛新杨是由来自河南的毛白杨无性系与来自新疆的新疆杨人工控制授粉杂交产生的，但还是没有来自山东省的毛白杨无性系鲁毛50杂合水平高。这也说明了毛白杨种内遗传多样性很高，不同区域的毛白杨遗传基础相差很大。而新疆杨由于主要分布在新疆等地比较窄的分布区域内，与其它种的杨树杂交机会较少，形成了在进化上较为保守，杂合位点较少的白杨派树种。用AFLP技术检测分离群体亲本平均杂合水平得出的结果是其真实杂合水平的最低估计。正如表 2所描述的，本研究检测到的仅为在亲本中基因型为Aa×aa在子代中显示1:1分离的A FLP多态性位点，而亲本基因型为Aa×Aa在子代中显示3:1分离的AFLP位点，在遗传分析中没有统计，对于亲本其它基因型如Aa×AA，用显性标记检测不到。因此本研究得到的对亲本平均杂合水平估计的结果偏低。Bradshaw等(1994)用RFLP标记技术检测到毛果杨和美洲黑杨的平均杂合水平分别为30%和15%。Marques等(1998)用AFLP技术估计细叶桉和蓝桉的平均杂合水平分别为30.5%和22.4%。Cervera等(2001)用AFLP技术估计美洲黑杨87001、美洲黑杨87002、欧洲黑杨和毛果杨的平均杂合水平分别为26%、21%、20%和20%。与已报道的其它杨树平均杂合水平相比，本研究中估计的毛白杨和毛新杨的遗传平均杂合水平偏低。其主要原因可能是报道的杂交组合类型大多数属于派间杂交类型，在子代和作图亲本中能检测到的多态性位点较多，而本研究用的杂交组合类型属于派内种间回交作图群体，所以在亲本和子代中检测到的多态性位点较少。

3 结论

AFLP标记是一种十分有效的遗传分析技术，它可在较短时间内从基因组水平上检测到毛新杨×毛白杨回交群体亲本毛白杨及毛新杨间大量的多态性位点，平均每对E₊₃/M₊₃引物组合可检测到该分离群体亲本间有17.87个多态性位点，多态性水平平均为27.4%。

采用30对AFLP引物组合及120个杂交子代检测分离群体亲本的遗传平均杂合度。结果表明，毛白杨的平均杂合度为18.71%；毛新杨的平均杂合度为8.47%。对于分离群体亲本杂合度来说，毛白杨为毛新杨的2倍多。