多酚氧化酶(polyphenol oxidase, PPO)是一种含铜酶，它能够催化酚类物质转变成醌。近几十年来，国内外对植物组织褐变的研究表明，组织的褐变主要是PPO作用于天然底物酚类物质所致。Chang等(1990)研究认为，儿茶酚是水果中PPO最重要的天然底物；王璋(1990)和Coseteng等(1987)指出，不同来源的PPO作用的天然底物是不同的，而且作用的最适天然底物不一定存在于同一植物体中。国内对果实采后组织褐变的研究，多注重贮藏中果实PPO活性的变化及其与果实品质变化之间的联系。关于枣果实采后贮存中PPO的活性变化，寇小虹等(2000)认为呈上升趋势，但关于PPO的天然底物种类、最适天然底物、pH值对PPO的影响等的研究尚未见报道。本文以我国有代表性的鲜食枣品种冬枣、梨枣为试材，对PPO性质进行了详细研究，旨在为枣保鲜问题的最终解决提供理论依据。

1 材料与方法 1.1 试验材料

冬枣，1999-10采自山东沾化；梨枣，1999-10采自北京郊区。枣果采后立即运回实验室，并将试材放置到-40℃冰箱中冷冻待测。

1.2 测定与分析方法 1.2.1 多酚氧化酶(PPO)的提取及活性测定

参照Coseteng等(1987)的方法，操作均在0~4℃进行。所用缓冲液为0.1 mol·L^-1柠檬酸-0.2 mol·L^-1磷酸氢二钠，用pHS-3C型酸度计测定冬枣、梨枣试材的pH值(均为5.5)，并在此pH值下配制相应pH值的缓冲液，测定PPO活性。

多酚氧化酶(PPO)的提取：①丙酮粉制备：取枣果肉100 g，加入0.8 g聚乙二醇(M=6000)，迅速加入200 mL冰丙酮(-40℃左右)，用高速组织捣碎机匀浆5 min，混合液用中速滤纸在漏斗架上过滤，残渣用冰丙酮反复冲洗，过滤，直至成为白色粉末，此粉末即为丙酮粉。放置室温干燥1夜后，称重，用滤纸包好，放入干燥器于0℃左右冰箱中保存。②酶液制备：称取1 g丙酮粉，加入20 mL相应pH的缓冲液，0℃下用磁力搅拌器匀浆30 min，在4000 rpm下离心30 min，取上清液，过滤，得粗酶提取液。

多酚氧化酶(PPO)活性的测定：以儿茶酚为底物，2.75 mL相应pH缓冲液，加入0.15 mL 0.2 mol·L^-1儿茶酚溶液(儿茶酚最终浓度为0.01 mol·L^-1, 用相应pH值的缓冲液配制)至比色杯中，加入0.1 mL酶液5s后开始扫描1min内A_420nm值的变化，酶活性以ΔOD_420nm·min^-1g^-1FW表示，重复3次。

1.2.2 pH值对PPO活性影响的测定

配制3.0~8.0系列pH值缓冲液，吸取2.4 mL缓冲液，加入由相应pH值配制的0.01 mol·L^-1儿茶酚0.5 mL，在(30±1)℃条件下保温10 min，加入0.1 mL酶液5s后开始扫描1min内A_420nm值的变化，酶活性以ΔOD_420nm·min^-1g^-1FW表示，重复3次。

1.2.3 PPO底物专一性的测定

酚类化合物定性分析：用高压液相色谱法，色谱条件为，柱：μ-Bondapak Phenyl(0.4 cm×30 cm)；流动相：35%甲醇-65% H₂O(H₃PO₄调至pH4.5)；流速：1 mL·min^-1；检测器：UV254 nm×0.1 AμFs。作用的底物有：儿茶酸、咖啡酸、儿茶酚、没食子酸、绿原酸(浓度均为0.01 mol·L^-1)，阿魏酸、香豆酸(浓度均为0.03 mol·L^-1)。

吸取在(30±1)℃保温10 min的底物2.9 mL(由相应pH缓冲液配制，最终底物浓度依其溶解度大小分别为0.01 mol·L^-1和0.03 mol·L^-1)于比色杯中，加入0.1 mL酶液5s后开始扫描1min内A_420nm值的变化，酶活性以ΔOD_420nm·min^-1g^-1FW表示，重复3次。

1.2.4 底物浓度对PPO活性影响的测定

用相应pH值缓冲液配制儿茶酚溶液。吸取2.5 mL儿茶酚溶液(浓度为5~60 μmol·L ^-1，浓度梯度为5 μmol·L^-1, 于室温17.5℃条件下配制)于比色杯中，加入0.5 mL酶液5s后开始扫描1min内A_420nm值的变化，酶活性以ΔOD_420nm·min^-1g^-1FW表示，重复3次。

2 结果与分析 2.1 枣果实中的酚类物质

用高压液相色谱(HPLC)对枣果实中酚类物质分析鉴定，不同品种所含的酚类物质不同(表 1)。

在冬枣中检出没食子酸、儿茶酸、绿原酸、儿茶酚、咖啡酸共5种酚酸；而梨枣只检出儿茶酸、香豆酸、阿魏酸3种酚酸。且2个枣品种只有一种共同的底物——儿茶酸，这表明不同品种PPO作用的底物可能是不同的。

2.2 pH值对PPO活性的影响

pH值对2个枣品种的PPO活性影响很大，PPO活性强烈依赖于pH值的大小(图 1)。由于PPO是含铜氧化酶，pH值较高或较低都会导致Cu²⁺的解离及蛋白质的变性，从而使PPO失去活性(王璋，1990)。图 1表明，pH值为7.0时，冬枣和梨枣PPO均出现活性高峰，说明7.0为二者PPO的最适pH值。

2.3 PPO的底物专一性

以作用于没食子酸的活性为100计，冬枣作用于其他酚酸的活性分别为儿茶酚97.07、咖啡酸77.33、香豆酸133.33、绿原酸82.00，而儿茶酸和阿魏酸则不表现酶活性。梨枣的PPO活性依强弱顺序为：阿魏酸(189.53)>儿茶酚(123.83)>香豆酸(120.07)>儿茶酸(108.30)>没食子酸(100)>绿原酸(72.20)>咖啡酸(45.66)。

可见，冬枣PPO作用的最适天然底物为没食子酸，而梨枣PPO作用的最适天然底物是阿魏酸。从试验结果看，冬枣PPO作用于香豆酸的活性是没食子酸的1.3倍，但香豆酸在冬枣中并不存在(表 1)，这说明PPO的最适底物不一定总和PPO同时存在于同一植物体中。另外，冬枣中咖啡酸和儿茶酚的含量分别为没食子酸的7.2倍和11.2倍，但以它们作为底物的PPO相对酶活性均低于没食子酸，这表明PPO的最适天然底物与其在植物体中的含量无关。

2.4 底物浓度对PPO活性的影响

试验结果见图 2。当底物浓度小于40 mmol·L^-1时，PPO活性与底物浓度呈正相关。底物浓度大于40 mmol·L^-1时，PPO活性开始减弱，并且降幅显著。这可能是由于酶的变性及产物的积累抑制了PPO的活性。底物浓度对PPO活性的影响，2个品种均显示出相同的规律，即随底物浓度的增加PPO活性增高，达到峰值后逐渐下降。

3 结论

采后冬枣和梨枣的游离酚酸种类有很大不同。冬枣中测到的游离酚酸为没食子酸、儿茶酸、绿原酸、儿茶酚和咖啡酸；梨枣则为儿茶酸、香豆酸和阿魏酸。冬枣、梨枣PPO的最适pH值均为7.0，在pH7.0时PPO活性最高。冬枣PPO作用的最适天然底物是没食子酸，梨枣PPO作用的最适天然底物是阿魏酸。