万寿菊(Tateges erecta)为1 a生草本, 是广泛分布于世界各地的观常性植物。近年来研究发现, 它的根提物对多种昆虫有很好的毒杀作用和光活化活性(Morallo-Rejesus, 1987; Philogene et al., 1985;乐海洋等, 1998;Isman, 1994)。但其杀螨活性在国内并无报道。本实验中发现, 万寿菊根的氯仿提取物对山楂叶螨(Tetranychus viennensis Zacher)有很好的触杀活性, 鉴于螨类以刺吸方式为害, 本文研究了在自然光照射和非光照条件下, 万寿菊根氯仿提取物内吸处理对山楂叶螨体内几种酶系的影响, 旨在寻找其对螨类的作用途径, 为进一步开发和利用提供科学依据。

1 材料与方法 1.1 材料

万寿菊采自山西太谷, 试螨采自山西农业大学果园内, 试验期间禁止施药。

1.2 方法 1.2.1 活性物质的提取

将采集到的万寿菊根阴干, 置于烘箱中50 ℃烘干后, 用电动粉碎机粉碎过60目筛。准确称取10 g根粉, 用滤纸包好后置于索氏提取仪中, 用氯仿(分析纯)100 mL, 80 ℃连续抽提6 h后, 将所得溶液浓缩至浸膏状, 用少量乙醇溶解, 加水配成浓度为每毫升含30 mg干粉的溶液备用。

1.2.2 供试叶螨的处理

选取果树向阳部位1~2 a生枝条上的健康叶片, 洗净后将柄端插入装有药剂的试管中浸泡72 h。叶片及试管上罩塑料网罩以防失水。72 h后将叶片取出浮贴在1%的琼脂胶上, 沿叶缘去除外周多余琼脂后将培养皿中注入少量水以防山楂叶螨逃逸。将每一叶片上接健康活泼, 虫龄一致的雌成螨30头, 使其在光照和非光照条件下取食不同时间后测定酶活性。

1.2.3 酶活性测试

将不同处理的试螨于不同时间制取酶液, 参照《植物化学保护研究方法》(慕立义, 1991)中的有关方法进行酶活性测定。

蛋白酶活性测定:以酪蛋白为底物进行测定。

酶液制备:分别于非光照条件下处理8 h、16 h、24 h、32 h、40 h、48 h和光照条件下处理0.5 h、1 h、1.5 h、2 h后取雌成螨100头, 加0.25 mL生理盐水冰浴中匀浆, 10 000 r·min^-1, 4 ℃下离心15 min, 取上清液备用。

蛋白含量测定:用Follin酚法测定。取酶液0.1 mL加0.3 mL生理盐水与Follin-酚甲液2 mL混匀静置10 min后加Follin-乙液0.2 mL摇匀, 在30 ℃水浴中反应30 min, 于500 nm处比色, 测定OD值。

蛋白酶活性测定:取制备好的酶液0.05 mL, 在37 ℃水浴中预热3~5 min, 加入1 mL预热到37 ℃的酪蛋白溶液, 混匀后置于37 ℃水浴中加热15 min, 加入3 mL 10%三氯乙酸, 混合后离心。取上清液1 mL, 加5 mL 0.5 mol·L^-1碳酸钠, 1 mL Follin-酚试剂, 在37 ℃水浴中显色15 min, 用分光光度计于680 nm波长处测光密度值。从绘制好的标准曲线上查出对应的酪氨酸微克数, 确定酶活力大小。

GSTs酶活性测定:酶液制备、蛋白含量测定同上。

活性测定:将66 mmol·L^-1磷酸缓冲液2.5 mL、50 mmol·L^-1 GSH 0.2 mL、0.03 mol·L^-1 CDNB0.05 mL迅速混匀作为对比, 将以上试剂再加0.1 mL制备好的酶液作为试样, 在27 ℃下置于UV-300型分光光度计340 nm处, 测定5 min内OD值变化。

酯酶及同工酶:用聚丙烯酰胺凝胶电泳法测定(陈长琨, 1993)。

2 实验结果 2.1 对蛋白酶活性影响

万寿菊氯仿提取物对山楂叶螨体内蛋白酶活性影响见图 1、2。

从图 1中可以看出, 山楂叶螨在非光照条件下取食的过程中, 对照组的蛋白酶活性变化与处理组有所不同, 对照组表现为先上升后又下降的变化过程, 在16 h时比活力值达到最大, 而处理组则表现为在小范围内先下降后有所上升的趋势, 且在处理16 h后酶活性为最低, 此时, 比活力值只有对照组的51%; 而在光照条件下, 蛋白酶活性变化与在非光照条件下的变化相似, 试螨接受2 h光照的阶段, 对照组比活力同样表现为先上升后下降, 而处理组表现为先下降后略有上升, 且在对照组活性达到最大时, 其活性表现为最小, 此时的比活力值只有对照组的28.9%, 酶活性受到明显抑制。蛋白酶是生物体内重要的消化酶系之一, 它活性的高低直接关系着生物体对食物的吸收和利用。在本实验中, 试螨体内蛋白酶活性的降低, 可能是由于万寿菊氯仿提取物中含有抑制蛋白酶的物质, 影响山楂叶螨对食物的正常消化, 从而导致机体饥饿死亡。

2.2 对谷胱甘肽-S-转移酶活性的影响

谷胱甘肽-S-转移酶是螨类体内最活跃的解毒酶系之一, 它能催化有毒的亲电化合物与内源性的还原型谷胱甘肽进行共轭反应, 保护它的亲核中心, 如蛋白质、核酸等。脂溶性的外源物质通过轭合作用, 形成易溶于水的化合物, 再经代谢排出体外, 达到解毒作用。

经万寿菊氯仿提取物处理的螨, 体内谷胱甘肽-S-转移酶有不同程度变化, 结果见图 3、4。在光照和非光照条件下, 两组试螨的GSTs酶的比活力值均表现为先上升后下降的趋势, 在非光照过程中, 处理组的比活力值在处理的0~32 h区域大于对照组, 尤其在处理后的24 h, 对照组的比活力值只有处理组的44%, GSTs酶活性被激活; 而光照条件下, 试螨在接受光照2 h的过程中, 处理组的酶比活力值在光照后的0.5~1.5 h区域值却低于对照组, 在处理后0.5 h, 处理组的酶活性为对照组的55%, 在该过程中, GSTs酶的活性受到一定抑制。

2.3 对酯酶同工酶的影响

万寿菊氯仿提取物对山楂叶螨体内酯酶同功酶作用后的凝胶电泳图谱见图 5。

从图 5中可以看出, 万寿菊氯仿提取物处理后, 在凝胶电泳图谱上可明显的看到3条酯酶酶带:α、β、γ, 用光照和非光照处理时, 这三条酯酶酶带变化有所不同, 其中γ带基本无变化, 而α和β带变化较大。处理0 h与新鲜对照相比, 其α、β带颜色较粗、较深; 在非光照处理时, 从图上可以看出处理组的这两条酶带在颜色和粗细上大都弱于对照组, 尤其在处理的32 h和40 h, 这种现象尤为明显; 在光照处理中, 处理组的变化与对照组相比, 也出现了同样的情况, 并且, 从整体上来看, 这种减弱辐度比非光照处理时明显。另外从处理后酯酶酶带随时间的变化趋势上来看, 处理组的酶带无论在光照还是非光照条件下, 酶带有逐渐减弱的现象, 而在两个对照组中, 没有这种趋势, 并且变化不明显。酯酶也是生物体内重要的解毒酶系之一, 当外源有毒物质进入生物体内时, 会激活酯酶进行解毒代谢, 其活性的升高往往是许多害虫产生抗药性的标志之一, 而当其活性受到抑制时, 会导致生物体内有毒物质进行积累, 产生中毒作用, 从而引起死亡。从本实验的结果来看, 处理组酯酶酶带颜色和粗度的减弱, 可能与其活性受到一定的抑制有关。

3 讨论

万寿菊是一种高效的杀虫植物, 尤其是它的光活化活性, 目前关于万寿菊杀虫活性和光活化活性的报道有很多, 但这些报道大都集中于鳞翅目、同翅目害虫及仓储害虫, 对螨类的光活化活性和作用机制的研究却开展很少。本实验中发现万寿菊对山楂叶螨有很好的杀虫效果, 并且发现山楂叶螨取食用浓度为30 mg·mL^-1(植物干粉的浓度)的药液处理的万寿菊叶片, 并经自然光照射0.5 h后, 出现极度兴奋, 虫体痉挛, 肢体竭力向外伸开, 头向后仰, 腹部上翅, 并在原地翻腾跳跃, 1.5 h后出现死亡的个体, 因此对其作用机理进行了初步的研究。

通过万寿菊氯仿提取物对山楂叶螨体内几种酶系的影响发现, 万寿菊氯仿提取物在光照条件下, 处理组与对照组相比, 蛋白酶、谷胱甘肽-S-转移酶的活性受到一定程度的抑制, 并且酯酶酶带颜色和粗度减弱; 而在非光照条件下, 与对照相比, 处理组的蛋白酶活性受到抑制, 谷胱甘肽-S-转移酶的活性增加, 而酯酶酶带无明显变化。外源性有毒物质在生物体内的代谢要先经过氧化、还原、水解等原发性代谢过程降解, 再经过轭合等继发性代谢过程形成易溶于水的化合物, 排出体外。其中水解和轭合是昆虫解毒代谢的重要方式, 由一系列酶系催化完成(张宗炳, 1989)。酯酶和谷胱甘肽-S-转移酶便是普遍存在于生物体内最重要的两种解毒酶系。

酯酶具有广泛的底物专一性和重迭性, 在杀虫药剂代谢中不需要额外能量即可催化酯类化合物水解, 当外源有害物质侵入生物体内时, 该酶会积极参与解毒代谢(宗静等, 2000; 吴青君, 1998)。这种高效的解毒代谢体系在生物体与外界不良环境因子的斗争过程中很可能发挥重要作用。谷胱甘肽-S-转移酶能催化生物体内的还原型谷胱甘肽(GSH)与外源化合物的亲电子基团发生轭合, 最终形成硫醚氨酸排出体外, 此外, 该酶在谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-PX)活力高的条件下, 还具有清除体内脂质过氧化物(LPO)的功能, 因此, GST兼有消除体内过氧化物及解毒的双重功能, GST的升高可作为动物组织损伤的敏感指标(沈同等, 1990; 深见顺一, 1994)。从本实验结果来看, 光照条件下, 处理组这两种酶活性受到抑制可能会使螨体内的正常解毒代谢受到影响, 从而导致有毒物质在螨体内积累, 引起死亡。而谷胱甘肽-S-转移酶活性的升高, 可能是由于万寿菊氯仿提取物中的有毒物质在其体内的增多而导致其解毒代谢的增加。

在本实验中蛋白酶在光照和非光照条件下都有所降低说明, 在万寿菊氯仿提取物中存在着光活化和非光活化物质, 它们都对螨体内的蛋白酶有抑制作用, 影响其正常的生理消化功能。

综合本实验的结果可以看出, 万寿菊氯仿提取物对山楂叶螨的生物活性主要属于光活化活性, 在万寿菊中主要的光活化物质为α-三噻吩, 但由于螨类在生物学方面有很多地方区别于昆虫, 因此其主要杀螨有效成分, 仍需进一步的研究。另外, 从黑暗条件下各处理的各项指标来看, 万寿菊氯仿提取物中可能也存在着不依赖于光活化活性的其它活性物质, 需进行深入分析研究。

值得提出的是螨类个体比较微小, 要获得大量均匀一致的研究材料较为困难, 并且在螨类的生理生化实验中不可能进行组织解剖, 只能整体磨碎匀浆, 这样酶活性可能很低, 甚至测不到酶活性, 因此在螨类的生理生化实验中不可避免的会出现误差, 这也是目前螨类生理生化研究开展不多的原因之一。