酯酶(esterase, EST)普遍存在于生物体内, 在对许多种昆虫的研究中证明, 作为一类重要的解毒酶系, 其活性的变化会直接影响杀虫药剂的毒力(宗静等, 2000)。高希武等曾对蚜虫(Aphis gossypii)、棉铃虫(Helicoverpa armigera)、小菜蛾(Plutella maculipennis)等昆虫进行研究, 结果表明, 有机磷农药和植物次生性物质通过对昆虫体内羧酸酯酶的抑制, 在一定程度上抑制了昆虫体内的解毒代谢(高希武等, 1998; 王旭等, 1998; 李腾武等, 1998)。因此, 了解酯酶活性的变化规律在杀虫药剂和昆虫解毒代谢间关系的研究中具有重要意义。

万寿菊(Tateges erecta)为一年生草本, 作为观赏植物分布在世界许多国家。它的提取物对小菜蛾、白纹伊蚊(Aedes albopictus)、中华按蚊(Anopheles sinensis)、谷蠹(Rhizopertha dominica)、黄粉甲(Tenebrio molitor)等昆虫具有良好的毒杀活性, 其中尤以光活化活性为主(乐海洋等, 1998; 赵善欢等, 1997)。

山楂叶螨(Tetranychus viennensis Zacher)主要为害北方果区果树, 由于近年来高强度的化学防治, 其抗药性日益增强。近来在对苹果树山楂叶螨的研究中发现, 万寿菊根氯仿提取物对该螨表现出较高的光活化活性。本试验以上述提取物作为处理药剂, 对试螨进行光、暗对照处理, 旨在探讨这种新型植物提取物在光、暗条件下与试螨酯酶解毒代谢之间的关系。

1 材料和方法 1.1 植物材料及次生物质提取方法

本试验所用万寿菊(T.erecta)采自山西太谷。

参考史志诚等(1996)的方法, 将万寿菊根于50 ℃下烘干、粉碎, 过40目筛。取根粉5 g置于索氏提取器中, 以100 mL氯仿作为溶剂连续回流提取6 h, 提取液趁热过滤, 减压浓缩至浸膏状, 取一定量上述提取物, 先以少量无水乙醇充分溶解, 再用蒸馏水稀释成不同浓度, 以此作为提取物处理药剂(TPC)。

1.2 试螨采集、饲养及待测样品的制备

本试验供试山楂叶螨(T.viennensis)采自山西农业大学附近平地果园, 为日龄和生长条件一致、未受农药污染的健康成螨。平时饲以新鲜苹果树叶片。

生物样品采用活体、离体两种处理方法制备。

活体处理组试螨预先进行药剂喷雾处理, 即将上述30 mg·mL^-1 TPC用喉头喷雾器均匀喷布于试螨体表, 经过24 h黑暗期后置于DRZ-日光色镝灯下照光2 h, 过程中定时取经处理的试螨100头加250 μL生理盐水, 冰浴匀浆, 4 ℃下8 000g离心15min, 上清液做电泳测定。同时设黑暗处理组和10%乙醇溶剂对照。

离体处理组选取试螨800头, 加1 600 μL生理盐水, 冰浴匀浆, 4 ℃下8 000 g离心15 min, 将上清液和不同浓度提取物按1:1体积比混合, 照光1 h, 产生前抑制, 再进行电泳测定。同时设黑暗对照处理组及相应乙醇溶剂对照。

1.3 酯酶同工酶聚丙烯酰胺凝胶电泳

采用不连续的垂直板聚丙烯酰胺凝胶电泳(王金胜, 1997)。分离胶浓度7.5%, pH8.9;浓缩胶浓度3.3%, pH 6.7;Tris-甘氨酸高离子浓度电极缓冲液, pH 8.3;上样量80 μL, 溴酚兰作前沿指示。预电泳电流为20 mA·板^-1, 样品进入分离胶后电流增至40 mA·板^-1, 6 ℃稳流电泳4 h。

酯酶同工酶染色液以pH6.4磷酸缓冲液配制, 内含底物0.05%醋酸-α-萘酯(70%丙酮溶解)、0.1%醋酸-β-萘酯(100%丙酮溶解)以及染色剂1%坚牢蓝RR盐, 37 ℃染色约10 min。染色完毕后胶版以7%醋酸固定, 离体组电泳图谱在UVP -凝胶成像系统下进行扫描分析, 在可见光条件下获取OD值。

2 结果与讨论 2.1 试螨体内酯酶同工酶电泳结果

30 mg·mL^-1TPC作用下试螨体内酯酶同工酶电泳结果见图 1。

通过聚丙烯酰胺凝胶电泳, 各处理组样品至少可清楚检测到三条山楂叶螨酯酶同工酶带(α、β、γ), 在乙醇黑暗对照处理组(b组)中, 各泳道酶带显色较深, 其中β带基本上由β₁, β₂, β₃组成。与之相比, TPC黑暗处理组(a组)各泳道β带明显减弱, 从位置上已检测不到β₁, β₃, 而α带和γ带的抑制作用不明显。光照条件下的两个处理组中, c组0.5, 1, 1.5, 2 h处理样品酶活性明显降低, 各酶带均有不同程度的抑制作用, 尤以β、γ带为显著。d组各泳道间酶带活性变化不大。总体上, 无论TPC光、暗处理, 对试螨酯酶同工酶都有抑制作用, 而光照条件下抑制作用较强。通过酶带分析可以看出, TPC对不同的酯酶同工酶抑制效果不同。此外, 两个TPC处理组都没有检测到除此以外的其它酶带。

2.2 试螨离体酯酶同工酶电泳结果

不同浓度TPC作用下试螨离体酯酶同工酶电泳结果见图 2。

1~5泳道为TPC光照处理组(a组), 提取物浓度依次为20, 40, 60, 80, 100 mg·mL^-1; 6~10泳道为无TPC处理组(b组), 以蒸馏水代替提取物, 其中6, 7, 8泳道为光照处理, 9, 10泳道为暗处理; 11~15泳道为TPC暗处理组(c组), 提取物浓度与a组相同; 16~19泳道为乙醇溶剂对照组(d组), 以10%乙醇代替TPC, 16, 17泳道为光照处理, 18, 19泳道为暗处理。

与活体试验结果相似, 通过电泳, 可清楚检测到三条山楂叶螨离体酯酶同工酶带α, β, γ。在不同处理组中, α带表现较稳定, 在a, c处理组, α带宽度随TPC浓度的增加逐渐变小, 而在b, d处理组, α带基本无变化。β带在不同处理组的表现有明显差别。在a, c处理组中, β带颜色随TPC浓度的增加逐渐减弱直至消失, 其中a组比c组变化显著; 而在b, d处理组, β带无明显变化。γ带在3条主酶带中表现最不稳定, 在a组检测不到该带, c组仅在低浓度TPC处理样品中存在(11~13泳道), b, d两组中各泳道均有γ带存在, 泳道间无明显差异。可见, TPC对3种同工酶都有抑制作用, 抑制程度为γ>β >α。

2.3 离体酯酶同工酶UVP-凝胶成像系统扫描分析结果

光照、黑暗条件下离体酯酶同工酶电泳图谱的UVP-凝胶成像系统扫描分析结果见图 3, 4。可以看出:未经TPC处理的试螨酶制备液在光照(LANE-6)、黑暗(LANE-10)处理1 h后, 均可清楚检测到α, β, γ 3条酯酶同工酶带。其中α带显色后OD值最大, β带次之, γ带OD值最小。

与LANE-6相比, 经TPC光照处理的酶制备液, α带OD值只有在100 mg·mL^-1浓度处理下(LANE-5)明显降低, 其它浓度下则基本无变化; 在20, 40 mg·mL^-1TPC浓度下(LANE-1、2)β带OD值明显减小, 而在60, 80 mg·mL^-1TPC浓度处理下(LANE-3、4)已无法检测到有效出峰面积和OD值, 至100 mg·mL^-1浓度处理(LANE-5), β带则完全消失; 所有TPC光照处理的酶制备液(LANE-1~5)均无法检测到γ带。

与LANE-10相比, 加入提取物的暗处理试螨酶源出峰曲线(LANE-11~15)随提取物浓度升高而呈现规律性变化。其中α带变化较小, 只是在峰面积上逐渐降低。各曲线中β带均存在但有所变化, 即从LANE-11至LANE-15 OD值依次降低, 峰面积也逐渐减小。γ带在各曲线中变化较大:20, 40, 60 mg·mL^-1提取物浓度处理(LANE-11、LANE-12和LANE-13)可检测到该带, 但OD值比LANE-10明显降低, 峰面积也有所减小; 而在80, 100 mg·mL^-1提取物浓度处理(LANE-14、LANE-15)中已无法检测到γ带。

上述扫描分析结果说明提取物在光、暗条件下均可在一定程度上抑制酯酶活性, 随提取物浓度增大, 抑制程度加剧, 主要表现为酶带数量和峰面积的变化。

3 小结

20世纪60年代Oppenoorth等发现抗有机磷杀虫剂的家蝇对萘乙酸酯等基质起水解作用的脂族酯酶产生解毒分解酶的变化, 发表了所谓突变脂族酯酶学说, 从此各种昆虫酯酶活性和抗性的关系受到广泛研究。现在认为, 酯酶(EST)是昆虫对杀虫药剂代谢最重要的酶系之一, 在许多昆虫的抗药性中起着重要作用(见顺一, 1994; 张宗炳等, 1989)。但不同的外源物质会对酯酶活性产生激活或抑制等不同的作用效果。

从本试验结果来看, 万寿菊根氯仿提取物在光照和非光照条件下对山楂叶螨酯酶都具有较高的抑制作用, 具体表现为随提取物处理浓度增大, 同工酶带数量减少、扫描曲线OD值降低及峰面积减小, 其中光照处理的抑制程度明显高于非光照处理。据此推测, 万寿菊根氯仿提取物在一定程度上通过抑制山楂叶螨体内酯酶的解毒代谢而起作用, 而在光照条件下这种抑制作用更为显著。然而由于在提取物暗处理条件下, 酯酶活性具有与光照处理相似的变化规律, 因此究竟是提取物内的光活化次生物质直接对酯酶起作用, 还是在光照条件下其通过改变生物膜的透性从而促使更多其它有害物质通过膜进入体内起作用, 这一点仍有待于做进一步研究。

此外, 本试验所有提取物处理组酯酶同工酶均表现为活性受到抑制, 而没有检测到新出现的同工酶带, 至于低浓度提取物处理是否会诱导新的酶带表达, 尚有待于开展进一步试验加以证实。